一种利用嗜盐细菌生产肌醇的方法

本发明涉及生物，具体涉及一种利用嗜盐细菌生产肌醇的方法。

背景技术：

1、肌醇又称环己六醇，作为一种重要的营养分子，肌醇不仅可以促进细胞生长，延缓细胞衰老，还可以作为抗癌药物合成前体，食品添加剂等，被誉为“生物活素”。肌醇广泛存在于植物、动物和微生物中，很多生物均能以肌醇作为碳源和能源进行细胞生长。目前，肌醇的生产主要来源于植物提取和化工合成，其中植物提取来源价格昂贵，收率低，过程复杂；而化工合成过程可控性差、污染大。近年来，通过微生物法或酶催化法生产肌醇也受到广泛关注。

2、自然界中选育的菌种生产肌醇的能力较低，因此目前多采用代谢工程改造结合合成生物学等学科的方式提产。然而，体外生物合成肌醇涉及多酶发酵、提纯，因此发酵工艺较为繁琐和复杂，也使得发酵成本大大提升。而常用的模式微生物大肠杆菌在中性环境中生长最佳，在生物生长过程中长期存在被污染的风险，在大规模工业发酵生产中更是需要输入大量的能量进行高温灭菌处理，因此在大规模、低成本工业发展中限制了其竞争优势。

技术实现思路

1、本发明的目的是将原本不生产肌醇的嗜盐菌微生物改造成高产肌醇的微生物，开发了低成本的肌醇或者肌醇与其他产物联产的生产平台，实现无灭菌、开放和连续发酵生产胞内或胞外产品。为了实现上述目的，本发明将导入基因(可以为外源或内源基因)导入嗜盐菌中，以实现肌醇的生产，通过优化基因表达量和肌醇培养发酵条件，最后实现肌醇的高产，以及与其他产物的高效联产。

2、本发明的第一方面，提供了一种生产肌醇的重组菌，所述的重组菌降低或缺失肌醇-2-脱氢酶。

3、优选的，所述的重组菌表达或过表达肌醇-1-磷酸合成酶。

4、进一步优选的，所述的重组菌表达或过表达葡萄糖激酶和/或肌醇单磷酸酶。

5、在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌降低或缺失肌醇-2-脱氢酶，同时表达或过表达肌醇-1-磷酸合成酶。

6、在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌降低或缺失肌醇-2-脱氢酶，同时表达或过表达肌醇-1-磷酸合成酶和葡萄糖激酶。

7、在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌降低或缺失肌醇-2-脱氢酶，同时表达或过表达肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶。

8、在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌降低或缺失肌醇-2-脱氢酶，同时表达或过表达肌醇-1-磷酸合成酶、葡萄糖激酶和肌醇单磷酸酶。

9、所述的重组菌可作为肌醇生产的底盘细胞。

10、所述的重组菌的基因组中缺失肌醇-2-脱氢酶基因(iolg)。

11、优选的，所述的重组菌中包含导入基因。

12、所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)、葡萄糖激酶基因(glk)或肌醇单磷酸酶基因(suhb)中的一种或两种或三种。

13、优选的，所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)。进一步优选还包含葡萄糖激酶基因(glk)和/或肌醇单磷酸酶基因(suhb)。

14、在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包括下列组中的一种：

15、1)缺失iolg基因；

16、2)缺失iolg基因，包含导入基因ino1；

17、3)缺失iolg基因，包含导入基因ino1和glk；

18、4)缺失iolg基因，包含导入基因ino1和suhb；

19、5)缺失iolg基因，包含导入基因ino1、glk和suhb；

20、6)包含导入基因ino1；

21、7)包含导入基因ino1和glk；

22、8)包含导入基因ino1和suhb；

23、9)包含导入基因ino1、glk和suhb。

24、优选的，所述的导入基因肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)来源于酵母基因组，在本发明的一个具体实施方式中，所述ino1经过密码子优化，ino1的核苷酸序列包含seq idno：1所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：1所示的核苷酸序列的同一性至少为80、82、85、90、95、96、97、98、99、100％的核苷酸序列。

25、优选的，所述的导入基因葡萄糖激酶基因(glk)来源于盐单胞菌td1.0基因组，在本发明的一个具体实施方式中，所述glk经过密码子优化，glk的核苷酸序列包含seq idno：2所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：2所示的核苷酸序列的同一性至少为80、82、85、90、95、96、97、98、99、100％的核苷酸序列。

26、优选的，所述的导入基因肌醇单磷酸酶基因(suhb)来源于盐单胞菌td1.0基因组，在本发明的一个具体实施方式中，所述suhb经过密码子优化，suhb的核苷酸序列包含seqid no：3所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：3所示的核苷酸序列的同一性至少为80、82、85、90、95、96、97、98、99、100％的核苷酸序列。

27、优选的，所述的重组菌为嗜盐菌或其衍生菌，进一步优选的，所述的嗜盐菌为盐单胞菌(halomonas)，更优选的，所述的盐单胞菌包括halomonas bluephagenesis、halomonascampaniensis或halomonas aydingkolgenesis，更进一步优选的，所述的盐单胞菌包括halomonas bluephagenesis td1.0(保藏号cgmcc no.4353)、halomonas campaniensisls21(保藏号cgmcc no.6593)和halomonas aydingkolgenesis m1(保藏号cgmccno.19880)。

28、优选的，所述的导入基因在嗜盐菌中表达。

29、优选的，所述的导入基因在一个或多个表达载体上表达或者在重组菌的染色体上表达。

30、在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入基因在染色体上的相同位置或不同位置表达。

31、所述的导入基因可以在现有技术中的任何常规启动子下表达。优选的，所述的导入基因在组成型或诱导型启动子下表达。所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子或其突变体。优选的，所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。

32、优选的，所述的porin启动子的突变体选自porin58、porin221、porin194、porin68、porin42、porin140、porin141、porin3、porin278、porin226或porin211中的一种或两种以上的组合。

33、优选的，所述的诱导型启动子可以为iptg诱导型mmp1启动子。

34、优选的，所述的iptg诱导浓度为0-400mg/l，例如，0、0.2、2、20、50、100、200或400mg/l。

35、优选的，所述的导入基因中的每一个可以独立地各自在一个或多个启动子的控制下表达，也可以相互组合用一个或多个启动子的控制下表达。

36、优选的，所述的导入基因中每个基因可以在一个表达载体或几个基因组合在一个或多个载体上。

37、本发明的第二方面，提供了一种生产肌醇的重组菌，所述的重组菌的基因组中缺失肌醇-2-脱氢酶基因(iolg)。

38、优选的，所述的重组菌中包含导入基因。

39、所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)、葡萄糖激酶基因(glk)或肌醇单磷酸酶基因(suhb)中的一种或两种或三种。

40、优选的，所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)。进一步优选还包含葡萄糖激酶基因(glk)和/或肌醇单磷酸酶基因(suhb)。

41、本发明的第三方面，提供了一种生产肌醇的重组菌，所述的重组菌中包含导入基因。

42、所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)、葡萄糖激酶基因(glk)或肌醇单磷酸酶基因(suhb)中的一种或两种或三种。

43、优选的，所述的导入基因包含肌醇-1-磷酸合成酶基因(ino1)。进一步优选还包含葡萄糖激酶基因(glk)和/或肌醇单磷酸酶基因(suhb)。

44、优选的，所述的重组菌的基因组中缺失肌醇-2-脱氢酶基因(iolg)。

45、本发明的第四方面，提供了一种上述的重组菌的制备方法。

46、优选的，所述的制备方法包括敲除或敲低重组菌中的肌醇-2-脱氢酶基因(iolg)。

47、优选的，所述的制备方法包括将导入基因导入重组菌。

48、优选的，所述的导入包括同时或分别导入所述的导入基因。

49、优选的，所述的导入包括但不限于替换、插入或转基因。

50、优选的，所述的制备方法优选为基因编辑技术，例如crispr-cas9或者loxp-cre系统。

51、在一个具体实施方式中，使用crispr-cas9敲除iolg基因和插入导入基因，所述的制备方法包括包括设计、合成靶向iolg基因和导入基因的grna。

52、在一个具体实施方式在，所述的靶向iolg基因的grna序列如seq id no：5所示。

53、在本发明的一个具体实施方式中，采用与大肠杆菌接合转化的方式将导入基因导入嗜盐菌。

54、优选的，采用表达载体将导入基因导入重组菌。使得重组菌中表达或过表达导入基因。

55、优选的，所述的表达载体中包含导入基因。

56、优选的，所述的导入基因在一个或多个表达载体上表达或者在重组菌的染色体上表达。

57、在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入为将导入基因插入嗜盐菌的基因组中。

58、本发明的第五方面，提供了一种生产肌醇的方法，所述的方法包括发酵培养上述第一、二或三方面的重组菌。

59、优选的，所述的发酵可以在基础培养基中培养。

60、发酵的基础培养基是指包含营养物质可以用于支持本发明微生物的生长的培养基。上述基础培养基可以是本领域常规用于微生物培养的培养基，比如矿物质培养基、lb培养基、mm培养基或牛肉膏蛋白胨等等，也可以是在这些培养基的基础上根据期望目的进行改良的培养基。也就是说，本领域技术人员可以常规选择合适的基础培养基，只要其能够允许微生物的生长即可。

61、优选的，发酵的碳源包括但不限于葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯中的一种或两种以上的组合。

62、在一个具体实施方式中，发酵的碳源为葡萄糖和葡萄糖酸钠，优选的，所述的葡萄糖和葡萄糖酸钠的比例为1：(0.5-2)之间的任一数值，例如1:0.5、1:1、1:2。

63、优选的，所述的碳源的浓度可以在1-200g/l，优选1-60g/l的范围内的任一数值，例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、80、100、150、200g/l等等。

64、优选的，发酵的盐(优选钠盐)包括但不限于氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖酸钠、硝酸钠、碳酸钠中的一种或两种以上的组合。

65、在一个具体实施方式中，所述的盐为氯化钠。

66、优选的，所述的盐的浓度可以在5g/l-100g/l范围内，优选为5g/l-80g/l，例如10-60g/l、20-30g/l，具体地可以是，例如，5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l等等。

67、优选的，发酵的氮源包括有机氮源和无机氮源，所述的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和/或氨水等，所述的有机氮源包括尿素、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、麸皮或废菌丝体中的一种或两种以上的组合。

68、在一个具体实施方式中，发酵的氮源为尿素。

69、优选的，所述的氮源的浓度可以在0-1g/l的范围内的任一数值，优选为0.2-0.5g/l或0.2-0.4g/l或0.4-0.5g/l，例如，0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1g/l等等。

70、在一个具体实施方式中，所述的发酵培养还包括加入酵母提取物、硫酸镁、磷酸二氢钾、微量元素溶液i和微量元素溶液ii，其中微量元素溶液i包括柠檬酸铁铵和cacl2以hcl配制，微量元素溶液ii包括znso4·7h2o、mncl2·4h2o、h3bo3、cocl2·6h2o，cuso4·5h2o、nicl2·6h2o和namoo4·2h2o以1m hcl配制。

71、优选的，所述的发酵在开放的条件下进行。

72、优选的，所述发酵的设备及培养基无需灭菌。

73、优选的，所述发酵的产物还包含pha或其他胞内或胞外产物，可以为天然或非天然。

74、本发明的第六方面，提供了上述重组菌在制备肌醇和/或pha中的应用。

75、本发明的第七方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含导入基因。

76、优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。

77、优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。

78、优选的，所述的表达载体为质粒。

79、本发明的第八方面，提供了一种包含上述表达载体的细胞。

80、本发明的第九方面，提供了一种上述表达载体或细胞在制备生产肌醇的重组菌或生产肌醇中的应用。

81、本发明的有益效果：

82、本发明重组菌生产肌醇及利用重组菌以低成本底物碳源进行肌醇和pha联产的方法，具有无需灭菌、设备简单和可以连续生产等特点，可以节约生产成本，容易扩大规模，具有很广泛的应用前景。

83、本发明所述的“pha”为均聚pha和/或共聚pha。优选的，所述的pha选自3-羟基丁酸(3hb)均聚物phb，3-羟基丁酸(3hb)和4-羟基丁酸(4hb)二元共聚物p3hb4hb，3-羟基丁酸(3hb)、4-羟基丁酸(4hb)和3-羟基戊酸三元共聚物p(3hb-co-4hb-co-3hv)，3-羟基丁酸(3hb)和3-羟基己酸二元共聚物phbhhx，3-羟基丙酸(3hp)的均聚物或共聚物，进一步优选的，所述的3-羟基丙酸(3hp)的均聚物为p3hp(聚-3-羟基丙酸酯)，所述的3-羟基丙酸(3hp)的共聚物为p(3hb-co-3hp)(聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基丙酸酯))。

84、在本发明的一个具体实施方式中，所述的pha选自3-羟基丁酸均聚物phb，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物p3hb4hb，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物phbv4hb，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物phbhhx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为p3hp，所述的3-羟基丙酸的共聚物为p(3hb-co-3hp)或phbhp。

85、本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

86、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

87、表1：部分英文缩写与中、英文全称对照

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