一种适用于现场检测的分子检测方法及装置与流程

1.本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种适用于现场检测的分子检测方法和装置。


背景技术：

2.随着现代生物技术的迅速发展，利用分子检测技术来获取待检物内的分子信息，已经被广泛使用。在一些情况下，为了及时、快速获得检测结果，需要对样品进行现场检测。分子检测包括核酸提取、核酸扩增和产物监测三个必要步骤，目前实验室常用的dna提取方法有ctab法、sds法、试剂盒法等。这些核酸提取方法需要用到离心机、移液器等实验设备，且操作繁琐，耗时较长。核酸扩增需要温度升降，操作复杂且需要昂贵的材料和设备，难以直接应用于现场检测。
3.等温核酸扩增，如环介导等温扩增(“lamp”)，因为其只需恒温装置(例如:水浴锅)，便能进行快速且高效的扩增反应，对仪器设备要求低，已被广泛使用。而为了适应现场检测方便、快捷的需求，也做了不少技术、相关装置上的适应性改进。例如，cn209537484u公开了一种用于核酸等温扩增快速检测的装置，包括密封瓶1，密封瓶1内设有反应内插管2，在核酸等温扩增快速检测实验中，往反应内插管2内加入100ul体系，旋紧瓶盖102，使密封瓶1保持密闭，放入63℃的恒温环境下温浴60min，扩增体系进行反应。该装置虽然能简单方便实现扩增，但是在户外的现场检测过程，至少还涉及到样品的处理、试剂的操控等步骤，采用该装置无法实现。


技术实现要素：

4.本发明提供一种适用于现场检测的分子检测装置，结合核酸扩增和微流控技术，可以在微流控芯片上同时实现核酸提取和基因扩增的功能，将采样、核酸提取、扩增、检测一次性完成，可在30min内对生物样本进行分子检测，适合于现场检测。
5.本发明采用如下的技术方案：一种适用于现场检测的分子检测装置，包括：一样品处理容器，用于对样品进行细胞裂解处理；一提取检测盒，包括核酸提取区和检测区；一加热平台，对提取检测盒的全部或检测区部分进行加热，达到核酸扩增的反应温度；其中，所述核酸提取区包括：一样品腔、一核酸结合腔和一废液腔以及一收集腔，所述样品腔具有注入孔，且样品腔与核酸结合腔流体连通，所述核酸结合腔分别与所述废液腔和所述收集腔之间通过阀门控制流体连通或关闭；所述核酸结合腔内置供核酸分子结合的提取载体；所述检测区包括：一反应腔和一检测腔，所述反应腔与所述收集腔流体连通，所述反应腔设置有注入孔。
6.现场检测技术涉及到样品的处理、试剂的操控和结果分析。微流控技术是一种在微纳米尺度上对流体进行精确操控的技术，能够利用小体积液体，在芯片中实现样品和试剂的自动处理、快速反应等，非常适合现场检测应用。本发明结合核酸扩增和微流控技术，利用结构上的巧妙设计，将样品核酸的提取与基因扩增集成在同一装置内进行，装置结构紧凑，体积小，占用空间小，且方便操作，简单、快捷实现核酸提取和基因扩增。
7.作为优选，所述核酸提取区还包括：一清洗液腔和一洗脱液腔，两者均设置有注入孔，所述清洗液腔与洗脱液腔均与所述收集腔之间流体连通。
8.本方案中，独立设置清洗液腔和洗脱液腔，清洗液与洗脱液分开注入，还可以将洗脱液或者清洗液预先存放于对应的腔内，关闭相对应的阀门，无需另外携带洗脱液与清洗液的存放装置，更加便携，使用时，只需要打开对应的阀门即可。在开口处配置密封盖。
9.作为优选，所述检测区还包括：一定量腔，所述定量腔进口端与所述收集腔流体连通，出口端与所述反应腔流体连通。定量腔的设置可以对反应液进行定量，满足检测的定量需要。
10.作为优选，所述检测区设置为多个，多个定量腔均与收集腔流体连通。可以实现一对多的高通量检测。
11.作为优选，所述加热平台具有加热槽，供提取检测盒的全部或部分插入。
12.作为优选，所述加热平台可用电池、电源或usb接口供电，也可搭建太阳能板，平台为多层，可同时加热多个芯片。
13.作为优选，该分子检测装置包含有对样品进行研磨的研磨工具，适用于需要研磨的样品处理，例如果实、叶片、根茎等样品。
14.更加具体地，所述研磨工具包括研磨棒和研磨管，也可以仅仅包含研磨棒，直接在样品处理容器内进行研磨。
15.作为优选，所述提取载体为滤纸或硅胶膜。
16.作为优选，该分子检测装置还包含取样工具，取样工具有取样管和取样剪，取样管一端是手柄，用来手握，另一端切口为斜面，取样时可以对待测样品进行刮擦采样，也可以刺入待测样品内部进行采集。根据所需样品多少，可以选择不同规格大小的取样管。样品坚硬或干燥不适于用取样管时，可以用取样剪进行采集，也可用取样剪将样品剪碎以方便核酸提取。
17.作为优选，该分子检测装置还包含抽取器，将样品处理容器内经过裂解的样品液抽取至样品腔内。
18.作为优选，所述抽取器为前端设置有毛细管的注射器。
19.在清洗液或者洗脱液经过样品腔对样品进行清洗或洗脱时，由于提取载体的存在，使得清洗液或者洗脱液的经过受阻，流经速度很慢，因此优选，所述样品腔的注入孔处设置有密封橡胶圈，密封橡胶圈的中心孔与注射器的毛细管口径适配，这样设置，注射器的毛细管插入后，可以与密封橡胶圈之间形成相对密封的状态，利用注射器像样品腔内注射，提供一定的压力，有利于清洗液或者洗脱液经过样品的速度，提高清洗与洗脱效率。
20.同理，也优选，在其它注入孔，例如反应腔的注入孔、检测腔的注入孔也设置密封橡胶圈，密封橡胶圈的中心孔与注射器的毛细管口径适配。需要对相应的腔室内的液体提供推送力，即可使用抽取器推送，使液体顺利进入下一程序。
lfd早期检测为例进行一对一的定性检测。
30.该分子检测装置包括：一提取检测盒100，一样品处理容器200，一加热平台300和一抽取器400。
31.提取检测盒包括核酸提取区1a和检测区1b；在两个区上面有一层透明的盖，可以观察到内部的情况。如附图1所示。
32.具体参见附图2，所述核酸提取区1a包括：一样品腔11、一核酸结合腔12和一废液腔13以及一收集腔14，所述样品腔11具有注入孔15，注入孔15突出于盖上面，方便注入样品，且样品腔11与核酸结合腔12之间通过毛细管16微量流体连通，所述核酸结合腔12分别与所述废液腔13和所述收集腔14之间通过毛细管16微量流体连通，并通过毛细管阀控制连通或关闭；所述核酸结合腔12内置供核酸分子结合的提取载体，提取载体可以是核酸结合滤纸或者硅胶膜。
33.所述检测区1b包括：一反应腔17和一检测腔18，所述反应腔17与所述收集腔14流体连通，所述反应腔17设置有注入孔15，反应腔17的注入孔15供注入反应液用，所述检测腔18可设置注入孔15，也可以不设置，根据检测手段而定，如果需要使用到检测液进行检测，则设置注入孔15，如果采用试纸等手段检测，预埋试纸在检测腔18内，此时则无需另设注入孔15。
34.加热平台300，如附图6所示，该加热平台300具有一个加热底座部，内置加热丝，其加热底座部上方的加热部具有一个或者多个加热凹槽，多个加热凹槽可以放置多个提取检测盒100，实现多个同时加热。将提取检测盒100的全部或者部分插入凹槽内，对提取检测盒100的全部或检测区1b部分进行加热，达到核酸扩增的反应温度。通常只需要对检测区1b的反应腔17进行加热即可，但是由于提取检测盒100通常体积较小，局部加热不方便，且难以控制加热部位，因此，对提取检测盒100进行整体加热。
35.样品处理容器200是一管状容器，如附图7所示，加入碎化后的样品后，再加入细胞裂解液。也有一些样品无需裂解，此时不需要加入裂解液。
36.抽取器400，将样品处理容器200内经过裂解的样品液抽取至样品腔11内。所述抽取器400如附图8所示，直接采用前端带有针头的注射器，要可以将针头替换为适配的毛细管16，毛细管16以塑料的软质、可弯曲的毛细管16为好。
37.该分子检测装置还包含取样工具，取样工具有取样管和取样剪，取样管一端是手柄，用来手握，另一端切口为斜面，取样时可以对待测样品进行刮擦采样，也可以刺入待测样品内部进行采集。根据所需样品多少，可以选择不同规格大小的取样管。样品坚硬或干燥不适于用取样管时，可以用取样剪进行采集，也可用取样剪将样品剪碎以方便核酸提取。
38.该分子检测装置还包含研磨工具，对样品进行研磨，适用于需要研磨的样品处理，例如果实、叶片、根茎等样品。所述研磨工具包括研磨棒和研磨管。研磨工具仅是本实施例中的一种实施方式，对本发明的分子检测装置不是必需的。对于无需研磨的样品不需要研磨工具，对于需要研磨的样品，也不一定是必需的，可以通过取样剪刀剪碎，同样可以达到目的。
39.装置中，除了提取检测盒为一次性，不重复使用，其它元件均可以重复利用。
40.本实施例同时提供一种适用于现场检测的分子检测方法，采用上述的检测装置，以水稻稻瘟菌raa-lfd早期检测为例进行一对一的定性检测，在稻苗叶片上用取样管进行
刮擦取样，新鲜稻苗样品可不经研磨直接进行检测。将样品放入裂解液中，震荡后吸取5ul裂解液，用抽取器将样品注入样品腔11，并控制样品流经核酸分子结合滤纸片，dna被吸附在滤纸中，其余液体进入废液腔13。然后用抽取器控制清洗液，经过样品腔11的注入孔15注入，流经滤纸片进行清洗，清洗液经过滤纸片进入废液腔13。然后用抽取器经过样品腔11的注入孔15注入洗脱液，将滤纸片上的dna洗脱，并进入收集腔14。收集腔14内dna被推送到反应腔17，通过注入孔15将反应液注入反应腔17，也可将反应液提前封入反应腔17。然后将芯片通过加热平台加热至39℃，维持20min，实现扩增反应，反应结束后将反应产物用抽取器将反应液推送到检测区1b，同时从注入孔15注入缓冲液，检测区1b包埋有试纸条，观察试纸条的检测线，从而判断样品是否含有稻瘟菌基因。
41.实施例2与实施例1的不同在于，在实施例1的基础上，在检测区1b内增加定量腔19，如附图3所示，位置位于收集腔14与反应腔17之间，所述定量腔19进口端与所述收集腔14通过毛细管16微量流体连通，出口端与所述反应腔17通过毛细管16微量流体连通。定量腔19还连通一个废液腔13，超过定量体积的溶液进入到废液腔13。定量腔19的设置可以对反应液进行定量，满足检测的定量需要。
42.实施例3与实施例2的不同在于，在实施例2的基础上，将所述检测区1b设置为多个，如附图4所示，本实施例设置3个，多个定量腔19均与收集腔14通过毛细管16微量流体连通，并连通有同一个废液腔13。收集腔14内的样品核酸分子进入到各个定量腔19，实现定量后，进入各个反应腔17、检测腔18分别进行反应、检测，可以实现一对多的高通量检测。
43.反应腔17所注入的反应液可以不同，检测腔18内的检测介质也可以不同，每隔反应腔17可以进行一个目标基因检测，实现一个样品，多种目标检测。比如在样品区制备水稻叶片dna，然后进入多个反应腔17，每个反应腔17检测一种病原菌，那就可以进行水稻病害的多重检测。
44.实施例4如附图5所示，与实施例2的不同在于，在实施例2的基础上，所述核酸提取区1a还增加：一清洗液腔10a和一洗脱液腔10b，两者均设置有注入孔15，所述清洗液腔10a与洗脱液腔10b均与所述收集腔14之间通过毛细管16微量流体连通。本实施例中，独立设置清洗液腔10a和洗脱液腔10b，清洗液与洗脱液分开注入，还可以将洗脱液或者清洗液预先存放于对应的腔内，关闭相对应的阀门，无需另外携带洗脱液与清洗液的存放装置，更加便携，使用时，只需要打开对应的阀门即可。在开口处配置密封盖。
45.实施例5：本实施例相比实施例1，有两处不同：1.所述样品腔11的注入孔15、反应腔17的注入孔15、检测腔18的注入孔15处设置有密封橡胶圈，密封橡胶圈的中心孔与注射器的毛细管16口径适配，这样设置，注射器的毛细管16插入后，可以与密封橡胶圈之间形成相对密封的状态，利用注射器像样品腔11内注射，提供一定的压力，有利于相应的腔室内的液体顺利进入下一程序。
46.2.该分子检测装置还增加一个箱体，用于容纳样品处理容器和提取检测盒等原件，便于整个装置的收纳、存放、携带。在箱体上设置提手。箱体内有对应各原件的适配槽。
槽内配置海绵垫，提供一定的缓冲，防止分子检测装置的损坏。