解淀粉芽孢杆菌来源的pH诱导型启动子及其应用

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌来源的ph诱导型启动子及其应用，属于生物。

背景技术：

1、解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属模式生物，由于其快速的生长速率被广泛应用于基础研究。又因其具有强大的蛋白分泌能力和是食品安全微生物的特点，解淀粉芽孢杆菌在酶制剂、代谢工程、抗体和饲料用菌制剂的生产领域也具有重要的应用。但是，随着合成生物学的发展，这些现有的工具已经不能满足研究者的需求。因此，为了更加快捷的对解淀粉芽孢杆菌进行基因改造，研究者开发了许多实用的基因调控表达工具。为扩展解淀粉芽孢杆菌遗传操作工具和拓展其应用范围，以往研究者对iptg、木糖、四环素、蔗糖等化学物质响应的诱导型启动子进行了深入研究，并将其应用于严谨诱导表达系统的构建。考虑到简化操作的步骤和避免诱导剂的添加，一些响应于特殊环境条件，如高ph、低溶氧、高温和高渗透压的新型启动子也开始应用于表达系统的构建。大多数的解淀粉芽孢杆菌发酵过程并不适合严苛的环境条件，构建自诱导表达系统具有更好的应用前景。因此，在解淀粉芽孢杆菌中构建新型的基因调控表达系统具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中解淀粉芽孢杆菌缺少表达工具，难以满足研究的需求的现状，筛选获得了在偏碱性环境(ph 7.0～8.0)中表达强度更强的芽孢杆菌内源启动子，可作为基因工程或代谢工程改造的工具。

2、本发明提供了ph诱导型启动子，具有如seq id no.1～10任一所示的核苷酸序列，所述启动子来源于保藏编号为cctcc no:m2016346的解淀粉芽孢杆菌nx-2s，能够启动在解淀粉芽孢杆菌中的转录。

3、在一种实施方式中，所述ph诱导型启动子为启动子picd、pglta或prace；所述启动子picd的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述启动子pglta的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述启动子picd的核苷酸序列如seq id no.8所示。

4、本发明还提供含有所述ph诱导型启动子的表达元件。

5、本发明还提供含所述ph诱导型启动子的重组表达载体，所述重组表达载体能够允许插入目的基因并使目的基因在细菌中表达。

6、本发明还提供含有所述表达元件或重组表达载体的微生物细胞。

7、在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌细胞或真菌细胞。

8、在一种实施方式中，所述细菌包括但不限于：大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。

9、在一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌nx-2s。

10、在一种实施方式中，所述微生物细胞以解淀粉芽孢杆菌nx-2s为宿主，以phy300plk为表达载体。

11、本发明还提供调控目的蛋白表达量的方法，所述方法包括：将编码目的蛋白的基因连接至所述ph诱导型启动子的下游，将含有所述基因的微生物在培养基中于合适的条件下培养，并在ph 5.0～8.0的环境下诱导所述ph诱导型启动子启动目的基因的转录。

12、在一种实施方式中，所述ph诱导型启动子为启动子picd、pglta或prace。

13、在一种实施方式中，所述启动子picd的核苷酸序列如seq id no.3所示。

14、在一种实施方式中，所述启动子pglta的核苷酸序列如seq id no.2所示。

15、在一种实施方式中，所述启动子picd的核苷酸序列如seq id no.8所示。

16、在一种实施方式中，所述培养环境的ph为7.0-8.0。

17、在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

18、(1)将编码目的蛋白的基因连接至表达载体上，并使所述基因位于所述的ph诱导型启动子的下游；

19、(2)将步骤(1)获得的重组表达载体通过电转的方法转入芽孢杆菌细胞中，获得表达目的基因的重组微生物；

20、(3)将步骤(2)获得的重组微生物在ph为5.0-8.0的环境下培养。

21、在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

22、(1)构建目的蛋白的基因表达框，并使所述ph诱导型启动子位于所述基因的上游；

23、(2)将步骤(1)构建的基因表达框整合至所述芽孢杆菌基因组上，获得表达目的基因的重组微生物；

24、(3)将步骤(2)获得的重组微生物在ph为5.0-8.0的环境下培养。

25、在一种实施方式中，所述表达载体以phy300plk为出发质粒。

26、在一种实施方式中，所述外源蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白。

27、在一种实施方式中，所述诱导是在ph 8.0诱导目的蛋白的表达。

28、本发明还提供了所述ph诱导型启动子、所述重组表达载体、所述重组微生物细胞或所述方法在调控目的蛋白表达方面的应用。

29、有益效果：本发明提供了解淀粉芽孢杆菌来源的ph诱导型启动子pamy、pglta、picd、pcitz、prace、ppgds、ppyk、ppgsb、ppgk、pcsca，其中，启动子pglta、picd、pcitz、ppgsb可在ph5.0～8.0的范围内提高蛋白的表达量，与对照相比使表达量提高2～40倍，在碱性环境诱导下有优良的表达效率，在ph 8.0的条件下能够使下游靶基因的表达相较于正常培养条件(ph 7.0)提高200％以上。

技术特征：

1.ph诱导型启动子，其特征在于，具有如seq id no.1～10任一所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述ph诱导型启动子的重组表达载体。

3.含有权利要求2所述重组表达载体的微生物细胞。

4.根据权利要求3所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为细菌细胞或真菌细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述细菌包括但不限于：大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。

6.一种调控目的蛋白表达量的方法，其特征在于，将编码目的蛋白的基因连接至权利要求1所述的ph诱导型启动子的下游，将含有所述基因的微生物在培养基中培养，并在ph5.0～8.0的环境下诱导所述ph诱导型启动子启动目的基因的转录。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白。

10.权利要求1所述的ph诱导型启动子，或权利要求2所述的重组表达载体，或权利要求3～5任一所述的微生物细胞在调控目的基因表达方面的应用。

技术总结
本发明公开了解淀粉芽孢杆菌内源pH诱导型启动子，属于合成生物学领域。本发明运用基因工程手段，从解淀粉芽孢杆菌基因组中筛选获得了10个不同表达强度的内源启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～10所示。并通过电击转化的方式使带有启动子的报告基因成功在解淀粉芽孢杆菌中表达。通过进一步筛选最终筛选获得了4种受碱性环境(pH 8.0)诱导的本源启动子。最终筛选的本源启动子响应范围在2‑40倍之间，有助于实现解淀粉芽孢杆菌中目的基因的可控性表达。

技术研发人员：罗正山,徐虹,严一凡,朱逸凡,杜姗姗,李莎,王瑞
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12