一种诊断和治疗宫颈癌的circRNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种宫颈癌circrna标志物及其应用。

背景技术：

1、宫颈癌是全球女性癌症死亡的第三大原因，仅次于乳腺癌和结直肠癌。宫颈癌是原发于子宫颈部位的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。近几十年宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。宫颈癌广泛性根治手术经过100多年的发展,技术逐渐规范化、成熟化，早期宫颈癌患者手术治疗疗效明确，五年生存率可高达80%以上，但术后复发转移仍严重威胁患者的生命。

2、近几十年来，宫颈癌rna分子的研究热度有增无减，特别是系统生物学的出现，让研究者们尝试从分子网络的角度解读和阐述宫颈癌的发生和进展，这也将成为未来研究的趋势。环状rna(circular rna, circrna)是一类内源性非编码rna，广泛存在于各种真核细胞中，没有5’端帽子结构和3’端poly a尾巴结构，通过反向剪接形成不同于线性rna的共价闭合环状rna分子，不受rna外切酶影响，具有进化保守性。一般认为，circrna可作为mirna海绵，参与选择性剪接和基因转录调控，并具有与rna结合蛋白相互作用和衍生假基因等功能，可能与人类癌症的发生和进展有关。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种宫颈癌circrna标志物，即hsa_circ_0002828环状rna（circ0002828）基因，并进一步提供该标志物在宫颈癌的诊断、治疗中的应用。

2、本发明的发明构思：

3、argonaute risc催化组分3 ago3（argonaute risc catalytic component 3，argonaute 3）又名真核翻译起始因子2c, 3 （eukaryotic translation initiationfactor 2c, 3或者eif2c3）编码在rna干扰中起作用的argonaute蛋白家族的成员，包含一个paz结构域和一个piwi结构域。研究发现ago3作为 rna 诱导的沉默复合物 (risc) 的关键组成部分，通过 rna 干扰负调控基因表达 (j biol chem)。ago 复合物通过与互补的microrna 结合来抑制 mrna 靶标，从而使 mrna 不稳定或降解。越来越多的研究表明，ago亚家族的失调与癌变有关，ago 可以调节各种肿瘤中的细胞增殖和/或活动性。在宫颈癌中， ago3蛋白通过调节wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌的恶性潜能（reprod biol.2021），这说明ago3（mrna翻译的）蛋白在宫颈癌中发挥促癌作用。

4、申请人经过一系列实验结果发现：来源于ago3基因的circrna hsa_circ_0002828在宫颈癌中显著低表达，且过表达hsa_circ_0002828后显著抑制了宫颈癌细胞的恶性表型，这说明hsa_circ_0002828可发挥与ago3蛋白相反的作用。通过检测hsa_circ_0002828丢失（表达降低）也可提前对宫颈癌的发生进行诊断（或预警），而通过对hsa_circ_0002828进行过表达（增加表达）则具有治疗宫颈癌的临床应用价值。

5、本发明通过以下技术方案实现：

6、第一方面，本发明提供一种宫颈癌circrna标志物，所述circrna标志物为hsa_circ_0002828，所述hsa_circ_000828的核苷酸序列如seq id no. 1所示。

7、circ0002828位于基因ago3内部，由3,4,5三个外显子组成， circ0002828的全长为467个碱基，全长序列为：ggaggtggttgactcaatggttcagcattttaaagtaactatatttggagaccgtagaccagtttatgatggaaaaagaagtctttacaccgccaatccacttcctgtggcaactacaggggtagatttagacgttactttacctggggaaggtggaaaagatcgacctttcaaggtgtcaatcaaatttgtctctcgggtgagttggcacctactgcatgaagtactgacaggacggaccttgcctgagccactggaattagacaagccaatcagcactaaccctgtccatgccgttgatgtggtgctacgacatctgccctccatgaaatacacacctgtggggcgttcatttttctccgctccagaaggatatgaccaccctctgggagggggcagggaagtgtggtttggattccatcagtctgttcggcctgccatgtggaaaatgatgcttaatatcgatg（seq id no. 1）。

8、第二方面，本发明提供一种检测上述宫颈癌circrna标志物的试剂在制备诊断宫颈癌的试剂盒中的应用。

9、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂包括特异性扩增所述hsa_circ_0002828的引物组。

10、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0002828的引物组包括正向引物和反向引物；

11、所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，即ctacgacatctgccctccat（seqid no.2）。

12、所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，即tgagtcaaccacctcccatc（seqid no.3）。

13、在具体的应用中，还包括内参gapdh的正向引物和反向引物：

14、内参gapdh primer f: ggagcgagatccctccaaaat（seq id no.4）；

15、内参gapdh primer r：ggctgttgtcatacttctcatgg（seq id no.5）。

16、第三方面，本发明提供一种宫颈癌诊断试剂盒，包括针对上述hsa_circ_0002828的特异性引物组；

17、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述引物组包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；

18、优选地，还包括荧光定量pcr试剂、rna提取试剂和逆转录反应体系。

19、第四方面，本发明提供一种上述宫颈癌circrna标志物的表达促进剂在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。

20、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述表达促进剂至少包括以下任一：hsa_circ_0002828环状rna基因；含有hsa_circ_0002828环状rna基因的重组载体；含有hsa_circ_0002828环状rna基因的重组病毒。

21、第五方面，本发明提供一种治疗宫颈癌的药物，其活性成分包括hsa_circ_000828的表达促进剂。

22、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

23、发明人研究发现，环状rna hsa_circ_0002828在宫颈癌患者的血浆中，相比于健康人的血浆，表达水平显著降低，由此提示，hsa_circ_0002828可作为宫颈癌的诊断标志物，其在宫颈癌的血浆中表达量显著降低，且能很好的预测宫颈癌的发生。同时，实验研究发现，hsa_circ_0002828过表达后，能够显著抑制宫颈癌胞的增殖能力和侵袭能力，并强烈诱导肿瘤细胞凋亡。这些结果说明hsa_circ_0002828既可以作为肿瘤诊断的标志物，也可以作为一种肿瘤治疗的潜在靶标，例如hsa_circ_0002828的表达促进剂可以用来制备治疗宫颈癌的药物中。