一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对DNA的甲基化方法

一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法
技术领域
1.本发明涉及dna甲基化领域，具体涉及一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法。


背景技术：

2.dna甲基化是通过不改变基因序列而引起遗传变化的最重要的表观遗传修饰之一1。通常dna甲基化的发生比较常见的是在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸cpg岛中胞嘧啶5位碳原子上，而异常的dna甲基化也是早期癌症发生的标志2。故dna甲基化分析已成为癌症诊断和治疗监测中最有前景的生物标志之一3，dna甲基化分析也得到了越来越多的研究，其中应用较广泛的dna甲基化分析方法包括亚硫酸盐处理法4和甲基化敏感限制性内切酶分析法5。亚硫酸氢钠处理法是dna甲基化分析方法中被认为是dna甲基化分析的金标准，它依赖于亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变6。该法可以区分甲基化胞嘧啶和胞嘧啶，也有较高的灵敏度，但它在亚硫酸氢钠转换时可能会导致dna降解从而使得dna浓度降低7。在此方法的基础上，通过如滚环扩增8(rca)、超支化滚环扩增9(hrca)、表面等离子体共振10和基于阳离子共轭聚合物的荧光共振能量转移dna甲基化分析方法11等新方法发展起来，但这些方法需要dna聚合酶介导扩增且其过程复杂，一定程度上限制了它们在临床试验的广泛应用12。甲基化敏感的限制性内切酶法通常包含未甲基化dna的裂解和后续甲基化dna的检测，当某dna序列被甲基化后，那么该序列将因内切酶无法识别和切割从而保留完整的原序列，而未甲基化的dna序列则被内切酶识别而消化掉从而发生裂解，而后续dna甲基化状态可以由电泳表征或定量分析确定，同时该法的条件温和，操作简单迅速13。通过此法与聚合酶链反应(pcr)、滚环扩增(rca)或重组酶聚合酶扩增(rpa)等扩增手法结合14，可以更容易分析dna甲基化，然而如果未甲基化dna消化不完全会导致出现假阳性的结果，从而无法达到低丰度的dna甲基化分析检测15。而有研究表明16，双甲基化敏感的限制性内切酶系统比单酶内切酶具有更强的消化能力，这很大程度上能解决未甲基化dna消化不完全而导致出现假阳性的结果，但扩增的结果还是会存在少量的假阳性。另外研究员们尝试不以扩增手段，如引入纳米颗粒作为dna探针或基底辅助物等进行电化学发光17或荧光检测18，这些方法虽然不会引起假阳性，也一定程度上可以降低dna甲基化的检测下限，但大多数研究分析dna甲基化的检测下限基本在fm级别以上。近年来，还有一些使用无标记并快速的方法(如电传感器19、表面增强拉曼光谱20和密度泛函理论(dft)21)进行dna甲基化分析，但这些方法只能分析检测浓度为pm级别以上的较高丰度的甲基化dna。因此若要分析更低丰度的dna甲基化，那么其检测下限是一个重要的挑战。
3.纳米孔传感器是具有简单实用性，单分子灵敏度高，独特无标签等优点的一种新型单分子检测技术22。近年来已成为一种很有前景的传感平台，并且已广泛应用于dna测序，小分子、蛋白质、酶和和生物分子等的检测23。而在各类纳米孔中，玻璃纳米孔是通过离子电流过孔而发生易位从而产生高信噪比的电流堵塞并进行监测和记录。而且玻璃管纳米孔具有超低的制造成本、良好的机械稳定性和可调节的孔径等优点而使其受到广泛的研究
24。另外聚合酶链反应(pcr)是一种可以对微量dna进行指数式扩增的分子生物学技术，也可看作是生物体外的特殊dna复制，具有很高的灵敏度。而通过pcr扩增所得的一定长度的产物双链可以通过玻璃纳米孔发生易位而产生电流堵塞，因此，通过玻璃纳米孔检测与双甲基化敏感的限制性内切酶系统结合可以很大程度上降低dna甲基化分析的检测下限，亚硫酸氢钠处理法在亚硫酸氢钠转换时可能会导致dna降解从而使得dna浓度降低。其延伸的方法步骤繁多，过程复杂，临床试验不广泛。甲基化敏感的限制性内切酶法可能会因未甲基化dna消化不完全而导致扩增时出现假阳性的结果，从而无法达到低丰度的dna甲基化分析检测。而像那些无标记并快速的方法(如电传感器、表面增强拉曼光谱和密度泛函理论(dft))对dna甲基化分析只能达到检测浓度为pm级别以上的较高丰度的甲基化dna。虽然引入纳米颗粒作为dna探针或基底辅助物等进行电化学发光或荧光检测一定程度上降低了dna甲基化的检测下限，但大多数研究分析dna甲基化的检测下限基本在fm级别以上，为此我们提出了限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，解决了上述的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述所述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，包括以下步骤：
9.第一步：用sept9片段作为甲基化分析片段，并将sept9嵌入puc57中，得到pcst9dna；
10.第二步：对pcst9dna进行甲基化处理，得到甲基化处理后的pcst9dna；
11.第三步：将甲基化处理后的pcst9dna以及未甲基化的pcst9dna进行双内切酶消化，经过甲基化处理的pcst9dna无法被hhai和bstui内切酶识别而保持完整的dna双链，未甲基化的pcst9dna则被hhai和bstui内切酶识别并完全消化；
12.第四步：对甲基化处理后的pcst9dna通过聚合酶链反应扩增出双链dna产物；
13.第五步：用玻璃管纳米孔传感器对双链dna产物进行分析，而双链dna产物在过孔时会产生大量的易位信号。
14.优选的，所述第三步中的双内切酶消化包括以下内容：将足够数量的甲基化与未甲基化pcst9dna各自加入到20μl包含1
×
rcutsmartbuffer，10uofbstuiand20uofhhai，然后在37℃和60℃各孵育1小时。
15.优选的，所述rcutsmartbuffer包括50mm醋酸钾、20mm氨基甲烷醋酸盐、10mm醋酸镁以及100μg
·
ml-1重组白蛋白，ph为7.9。
16.优选的，聚合酶链反应包括以下类容：5μl正向引物和反向引物与2
×
pcrmastermix混合后，加入5μl甲基化处理后的pcst9dna，最后添加10μl无酶水至总反应体系为50μl。
17.优选的，2
×
pcrmastermix包括25μl扩增酶，反向引物为5μm。
18.(三)有益效果
19.与现有技术相比，本发明提供的限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，具备以下有益效果：
20.1、该限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，高灵敏度纳米孔检测技术与高效率的基于聚合酶链反应(pcr)的双甲基化敏感的限制性内切酶系统结合使得dna甲基化分析的灵敏度大大增高，并且达到了0.2385am的检测下限。
附图说明
21.图1中(a)为本发明实施例双甲基化敏感的限制性内切酶系统的消化策略示意图；(b)为玻璃纳米孔分析图；
22.图2中(a)为本发明实施例puc57或pcst9扩增300、400和800bp的电泳表征；(b)为300、400和800bp相对应的引物在puc57-sept9上的位置示意图；
23.图3为本发明实施例不同组分电流轨迹(偏压1000mv)与事件峰值高度分布直方图；
24.图4为本发明实施例317/406/806bp双链dna验证实验示意图；
25.图5为本发明实施例有无酶切甲基化与未甲基化pcst9dna的406bp双链dna的示意图；
26.图6中(a)为甲基化dna浓度对事件率的依赖性(检测范围：10am-100pm)；(b)为测量的puc57-sept9dna甲基化水平与输入的puc57-sept9dna甲基化水平在0.1～1.0％范围内线性相关示意图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例
29.请参阅图1-6，本实施例提供的限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，包括以下步骤：
30.用sept9片段作为甲基化分析片段，并将sept9嵌入puc57(puc57-sept9)中以便进行聚合酶链反应(pcr)。扩增后的双链dna产物则作为玻璃纳米孔检测的样本。首先，在图1a中，经过甲基化处理的puc57-sept9dna无法被hhai和bstui内切酶识别而保持完整的dna双链，从而用我们设计出的与puc57-sept9dna相关的引物并以甲基化puc57-sept9dna为模板通过聚合酶链反应(pcr)时可以扩增出双链dna产物。未甲基化的puc57-sept9dna则被hhai和bstui内切酶识别并完全消化，使其无法进行聚合酶链反应(pcr)。然后，用玻璃管纳米孔传感器对双链dna产物进行分析，而双链dna产物在过孔时会产生大量的易位信号，如图1b。
31.为了验证sept9有无嵌入puc57质粒中，我们在sept9嵌入puc57质粒的基础上设计了三对引物(317、406和806bp)，其中，317和406bp的反向引物所在位置在sept9片段上，而806bp的正反向引物所在位置均在puc57质粒上，如图2(b)。图2(a)中，我们可以看到317和406bp在puc57质粒中嵌入sept9片段的dna上都可以扩增出相应的dsdna产物，而以没有嵌
入sept9片段的puc57质粒为模板时是无法进行pcr扩增的。由于806bp的正反向引物所在位置均在puc57质粒上，不管有无嵌入的sept9片段均是可以进行pcr扩增的，但是以puc57质粒为模板扩增出了503bp的dsdna产物，而在嵌入sept9片段的puc57双链dna上则能扩增出806bp的dsdna产物。因此，将sept9片段嵌入puc57质粒中是成功的。我们在后面的描述中将嵌入sept9片段后的puc57质粒均简称为pcst9dna(puc57-sept9dna)。
32.在pcr扩增之前，将puc57质粒(2710bp)与pcst9dna(3013bp)的cpg甲基化也可以直接通过玻璃纳米孔检测，经过cpg甲基化处理的mcpuc57质粒与mcpcst9dna和没有经过cpg甲基化处理的puc57质粒与pcst9dna通过玻璃纳米孔检测分析得到的电流分布大部分在0.3-0.4之间，峰数也都差不多，说明cpg甲基化处理对puc57质粒与pcst9dna没有影响，如图3(a、b、e和f)。经过cpg甲基化处理的mcpuc57质粒与mcpcst9dna和没有经过cpg甲基化处理的puc57质粒与pcst9dna都用hhai和bstui内切酶进行消化切割时，puc57质粒与pcst9dna几乎被消化完全了，通过玻璃纳米孔检测分析得到的电流分布主要在0.03-0.04之间，说明以hhai和bstui这种双甲基化敏感的限制性内切酶系统对具有很强的酶切能力，而mcpuc57质粒与mcpcst9dna几乎没有受到影响，如图3(c、d、g和h)。又由于puc57质粒与pcst9dna直接通过纳米孔检测的分析不相上下，因此不能以整个质粒作为中心检测思想，只能挑出几个片段进行检测，故我们该工作主要检测sept9片段。
33.参阅图3：不同组分电流轨迹(偏压1000mv)与事件峰值高度分布直方图。(a、b)puc57与puc57-sept9；(c、d)仅酶切后的puc57与puc57-sept9；(e、f)仅甲基化处理的puc57与puc57-sept9；(g、h)甲基化后酶切的puc57与puc57-sept9。
34.为了更好的用玻璃纳米孔选择性地检测甲基化的sept9dna，对三种不同片段dsdna产物进行比对，而某种孔径(此处选用15nm)的玻璃纳米孔可以识别并区分不同片段的dsdna在不同的分布区域，通过玻璃纳米孔在-1000mv电压下对以4mlicl高浓度缓冲体系的317bp、406bp和806bp的dsdna产物进行检测分析时，得到了每个标记不同的事件种群(图4b，c和d)，这表明玻璃纳米孔具有很高的分辨率不仅能识别不同碱基对数目的dsdna，也能识别不超过1kbp的dsdna。相对于317bp和406bp，同一pcr扩增程序下，806bp较长且其扩增效率不高(图4a)，所以不以806bpdsdna作为主要的纳米孔检测结果。图4(c和d)显示317bp和406bp电流分布区域很相近，甚至有一小部分重叠区域，但是317bp与406bp相比峰高较低，它的引物gc含量也相对较多。因此，综合考虑选406bp作为后面主要的玻璃纳米孔检测分析片段。
35.图4：317/406/806bp双链dna验证实验。(a)电泳表征结果；(b)电流轨迹；(c)事件峰值高度分布直方图；(d)电流-停留时间散点图。
36.甲基化与未甲基化的pcst9dna用hhai和bstui内切酶切割以验证双甲基化敏感的限制性内切酶系统具有强大的酶切能力。图5a可以明显观察到只有双内切酶切割后未甲基化的pcst9dna为模板扩增406bp双链dna经过纳米孔检测是没有信号的。图5c中的电泳表征可以看出未甲基化的pcst9dna几乎完全被双内切酶系统消化掉，通过纳米孔分析的事件峰值高度分布直方图也表明双内切酶切割后的未甲基化的pcst9dna是无法进行pcr扩增的，而图5(b，d和e)所分析的事件峰值高度分布直方图显示双内切酶切割后的甲基化的mcpcst9dna与无酶切也无甲基化的pcst9dna基本是一致的。
37.参阅图5：有无酶切甲基化与未甲基化pcst9dna的406bp双链dna的(a)电流轨迹
(偏压1000mv)、(b、c、d和e)事件峰值高度分布直方图(其中c中包含插图-电泳表征结果)。
38.参阅图6：(a)甲基化dna浓度对事件率的依赖性(检测范围：10am-100pm)；(b)测量的puc57-sept9dna甲基化水平与输入的puc57-sept9dna甲基化水平在0.1～1.0％范围内线性相关。
39.1.双内切酶消化
40.将足够数量的甲基化与未甲基化puc57-sept9dna各自加入到20μl包含1
×
rcutsmartbuffer(50mm醋酸钾，20mm氨基甲烷醋酸盐，10mm醋酸镁，100μg
·
ml-1重组白蛋白，ph7.9)，10uofbstuiand20uofhhai，然后在37℃和60℃各孵育1小时。
41.2.聚合酶链反应(pcr)体系
42.5μl正向引物和反向引物(5μm)与25μl扩增酶(2
×
pcrmastermix)混合后，加入5μl模板dna，最后添加10μl无酶水至总反应体系为50μl。
43.表1本技术所用核酸
44.[0045][0046]
高灵敏度纳米孔检测技术与高效率的基于聚合酶链反应(pcr)的双甲基化敏感的限制性内切酶系统结合使得dna甲基化分析的灵敏度大大增高，并且达到了0.2385am的检测下限。
[0047]
一种限制性内切酶与纳米孔检测结合对dna的甲基化方法，用sept9片段作为甲基化分析片段，并将sept9嵌入puc57(puc57-sept9)中以便进行聚合酶链反应(pcr)。扩增后的双链dna产物则作为玻璃纳米孔检测的样本。首先，在图1a中，经过甲基化处理的puc57-sept9dna无法被hhai和bstui内切酶识别而保持完整的dna双链，从而用我们设计出的与puc57-sept9dna相关的引物并以甲基化puc57-sept9dna为模板通过聚合酶链反应(pcr)时可以扩增出双链dna产物。未甲基化的puc57-sept9dna则被hhai和bstui内切酶识别并完全消化，使其无法进行聚合酶链反应(pcr)，用玻璃管纳米孔传感器对双链dna产物进行分析。
[0048]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。