快速鉴定蓝莓果型大小的分子标记引物组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及一组快速鉴定蓝莓果型大小的分子标记引物组合及其应用，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.蓝莓(vaccinium spp.)为杜鹃花科(ericaceae)越桔属(vaccinium)小浆果果树，原产于北美地区，在我国境内东北、西北和华东等地山区均有分布。由于我国在蓝莓品种选育及栽培上起步较晚，在生产上的栽培品种仍然以欧美等国家选育的品种为主，主要分为高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓三大类群，其种质资源遗传背景差异较大。蓝莓品种繁多，不同品种之间果实的大小、形状、果实风味和成熟期等影响果实品质的指标均不相同。其中，蓝莓果实的大小对蓝莓采收与销售均有重要影响，若蓝莓的果实偏小，人工采收比较费工；而大果型蓝莓果有利于采收，同时也有助于降低采收成本。从消费偏好来看，消费者偏向于购买大果型的蓝莓果实。因此，选育出品质优的大果型蓝莓优良品种，可以有效提高其生产经济效益。
3.由于蓝莓为木本植物，传统的杂交育种需要较长年限，人工杂交、育苗、果实成熟后进行子代选择、品系繁殖检测、品种鉴定等过程需要10年以上才能培育成一个新的品种。令人欣慰的是，遗传标记的出现及发展使育种学家开始应用分子标记辅助育种来提高育种效率。然而，分子标记的应用在蓝莓中大部分是关于遗传多样性分析、品种鉴定等方面，而关于分子标记辅助育种方面研究报道很少，尚处于探索阶段。本发明利用与蓝莓果实大小形态相关的特异dna分子标记，可以在短时间内对蓝莓育种材料的果实大小形态进行早期鉴定，从而可以大大加速育种的进程。本发明中的蓝莓果实大小形态性状特异位点是经过蓝莓主栽品种与优株群体dna重测序结果，并展开全基因组关联分析获得，最后经过蓝莓自然群体验证，其鉴定准确性较为可靠。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一组可用于快速鉴定蓝莓果型大小性状的分子标记引物组合。
5.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一组快速鉴定蓝莓果型大小性状的分子标记引物组合，包括bs-23250-f和bs-23250-r，具体序列为：
6.bs-23250-f：5
’‑
ctttctattctcgtgttctgtaatt-3’，
7.bs-23250-r：5
’‑
ccaaccaaattattatttgagaa-3’。
8.本发明还公开了上述的分子标记引物组合在快速鉴定蓝莓果实大小形态性状中的应用。
9.其步骤包括：
10.(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物bs-23250；
11.(2)dna的提取：提取蓝莓叶片的基因组dna；
12.(3)pcr扩增：基于上述蓝莓叶片基因组dna，使用步骤(1)合成的引物bs-23250-f和bs-23250-r进行pcr扩增，预先加入至少一个已确定蓝莓果实大小形态类型为小或中果型的样本dna作为内参；
13.(4)扩增产物检测与分析：对pcr产物进行基因型检测分析，若有pcr扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即视为同一果型大小形态类型，即为小或中果型蓝莓；若没有任何pcr扩增产物出现者视为大或超大果型蓝莓。
14.其详细步骤为：
15.(1)引物合成：委托生物技术公司合成引物bs-23250；
16.(2)dna的提取：
17.a、用液氮研磨0.2g左右的蓝莓幼叶成粉末状置于2ml离心管中；
18.b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spin column plant genomic dna purification kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；
19.c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
20.(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板1.0μl(10ng/μl)，2
×
sg fast qpcr master mix(low rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。
21.(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)30个循环；待pcr反应结束后可直接由abi q6 flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelic discrimination plot)便知样本果实大小形态性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(加入1个已确定为“小或中果型”的蓝莓种质样本作为内参)且与内参样本聚集为一组者即视为同一果型性状，即为小或中果型蓝莓；相反，若没有任何pcr扩增产物出现者视为大或超大果型果实形态类型蓝莓种质。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.本发明中分子标记引物bs-23250扩增产物片段仅为100bp，基于蓝莓不同果型群体中基因组dna中特异snp位点开发而成，稳定性及适用性较好，尤其适用于荧光定量pcr仪等高通量分型检测平台，其应用过程中的pcr扩增耗时短，循环数仅为30个；从提取蓝莓叶片样本dna开始直至获得最终鉴定结果，仅需1.5小时；并且从pcr扩增到最终分型结果数据的获取为全程闭管操作，无需再进行后续凝胶电泳检测，实现零污染；同时，样品基因组dna模板量仅需10ng即获得分型检测结果，具有快速、高通量和高灵敏度及准确性高的特点。
附图说明
24.图1为蓝莓种质资源dna样本的bs-23250引物在荧光定量pcr仪平台上的分型效果。
具体实施方式
25.下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本
发明保护范围。
26.实施例1
27.一组鉴定蓝莓果实大小形态性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：
28.(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物bs-23250；
29.表1：bs-23250引物序列信息
[0030][0031]
(2)待测蓝莓种质资源样品叶片dna的提取：
[0032]
a、用液氮研磨0.2g左右的蓝莓幼叶成粉末状置于2ml离心管中；
[0033]
b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spin column plant genomic dna purification kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；
[0034]
c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
[0035]
(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板1.0μl(10ng/μl)，2
×
sg fast qpcr master mix(low rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。
[0036]
(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)30个循环；待pcr反应结束后可直接由abi q6 flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelic discrimination plot)便知样本果实大小形态性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(预先加入1个已确定为小或中果型的蓝莓种质样本dna作为内参)且与内参样本聚集为一组者即视为阳性，系同一果型类型，以“+”标记，即判定为小或中果型蓝莓种质；相反的，若没有任何pcr扩增产物出现或者为其他基因型者均视为其他果型，为阴性，以
“‑”
标记，即判定为大或超大果型种质。最后，使用表格记录所有蓝莓种质样品果实大小形态鉴定结果(表2)，后续经过结果期观察确定其真实果实大小形态性状，仅有2份蓝莓种质果型大小形态鉴定错误，因此，最终的蓝莓果实大小形态性状鉴定准确率约90％，具体分型效果见图1。同时，也可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于蓝莓果实大小形态的早期辅助鉴定。
[0037]
蓝莓果型大小的区分标准为《ny t2521-2013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南蓝莓》。
[0038]
本实例中荧光定量平台96孔加热模块可根据需要进行更换为384孔以及流体芯片等，以满足更高通量分型检测需求。
[0039]
表2本发明实例中所用到的20份蓝莓种质资源果实大小形态性状鉴定结果
[0040][0041]
注：*分型结果图中与“小或中果型”蓝莓果实形态内参样品聚为一类者用“+”，其余样品均用
“‑”
表示，判定为大或超大果型蓝莓。