一种植物乳杆菌HYF15及其应用

一种植物乳杆菌hyf15及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌hyf15及其应用。


背景技术：

2.骨质疏松症是一种以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质比例不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险升高为症状的骨代谢障碍性疾病。骨质疏松症已成为威胁中老年人及绝经期妇女正常生活的主要疾病之一。
3.植物乳杆菌是乳酸菌的一种，在发酵食品中种类众多，并具有潜在的益生功能。同时植物乳杆菌作为人体胃肠道内重要的益生菌群，对人体健康发挥着及其重要的作用，相关研究表明植物乳杆菌可耐酸耐胆盐并可以在肠道中定殖，具有改善肠道菌群紊乱、缓解高糖高脂饮食所导致的代谢综合征、显著降低空肠弯曲杆菌毒力基因的转录并能抑制其在肠道的感染等健康功能。
4.现有植物乳杆菌与卵巢引起的骨质疏松、继发性骨质疏松等方面的相关报道，但并未见有植物乳杆菌可预防和/或治疗缺钙引起的骨质疏松的报道。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种植物乳杆菌hyf15及其应用，该菌株可促进缺钙情况下机体对钙的吸收，进而减轻骨质疏松症状。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种植物乳杆菌hyf15，于2018年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.16648。
7.上述植物乳杆菌hyf15在低钙条件下可有效促进机体对钙的吸收，从而减轻骨质疏松情况，具体为：通过ain93-低钙饲料建立小鼠缺钙模型，探究了植物乳杆菌hyf15通过pth通路对小鼠钙吸收的影响，得出如下结论：
8.(1)植物乳杆菌hyf15可以有效促进小鼠血清中的钙磷平衡，提高碱性磷酸酶alp的水平，从而促进小鼠的骨发育和营养摄入。
9.(2)通过elisa实验数据得出，灌胃植物乳杆菌hyf15组的小鼠并未通过提高小鼠血清中与骨发育相关的物质水平来促进钙吸收和骨形成。
10.(3)通过qpcr实验结果得出，植物乳杆菌hyf15可以通过提高小鼠小肠中pth和pthr的水平来激活gs/camp/pka信号通路，并促进小鼠小肠中pth通路相关基因中mrna的表达，从而提高小鼠机体对钙的吸收。
11.(4)由骨相关ct数据可以得出，植物乳杆菌hyf15可以促进小鼠骨密度和骨体积的提高，改善小鼠骨小梁的发育。
12.由上可知，植物乳杆菌hyf15可促进缺钙机体对钙的吸收。
13.可将上述植物乳杆菌hyf15制成预防和/或治疗缺钙引起的骨质疏松产品，上述产品可以是药品、保健品、食品、饲料等。
14.如：一种药品，包括上述植物乳杆菌hyf15。
15.一种保健品，包括上述植物乳杆菌hyf15。
16.一种食品，包括上述植物乳杆菌hyf15。
17.一种饲料，包括上述植物乳杆菌hyf15。
附图说明
18.图1为菌落形态图。
19.图2为100倍油镜下，菌株革兰氏染色后的细胞形态图。
20.图3为小鼠小肠中pth相对表达量结果。
21.图4为小鼠小肠中pthr相对表达量结果。
22.图5为小鼠小肠中gs相对表达量结果。
23.图6为小鼠小肠中ac相对表达量结果。
24.图7为小鼠小肠中pka相对表达量结果。
25.图8为小鼠小肠中β-action相对表达量结果。
26.图9为小鼠骨相关数据。
27.图10为小鼠骨小梁数据。
28.图11为小鼠组织体积结果。
具体实施方式
29.以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.实施例1：菌株的分离与鉴定
31.一、实验材料
32.采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县地区的牧民家中的传统自然发酵牦牛酸奶，无菌勺子充分搅匀酸奶后，用无菌注射器吸取50ml到已灭菌的离心管中，装入低温食品采样箱内带回实验室冷冻保藏于-80℃的超低温冰箱中备用。
33.二、分离纯化
34.分别取1ml酸奶样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6
，然后取10-4
、10-5
、10-6 3个梯度的菌液100μl进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复多次，直至得到形态一致的纯的单菌落。
35.三、初步鉴定
36.挑取平板上的纯菌落接种于5ml mrs液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1ml于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。
37.四、分子鉴定
38.1、dna提取
39.将已纯化的目标菌株接种于mrs肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组dna
提取试剂盒进行dna提取。将提取完成的dna做好编号，放于-20℃冰柜保藏备用。
40.2、基因组dna pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
41.提取完的dna进行pcr扩增，其中上游引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3'，seq id no.1)1μl、下游引物1495r(5'-ctacggctaccttgttacga-3'，seq id no.2)1μl，2
×
taq plus buffer 12.5μl、模板dna 1μl，用无菌dd h2o将体系补足至25μl。并以无菌超纯水替代模板dna作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。
42.然后取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.2％，电泳条件为110v，45min。将检测成功的pcr产物送往北京擎科生物技术有限公司进行测序，测序成功的序列使用ncbi中的blast(basic local alignment search tool)程序进行比对分析。
43.五、测定结果
44.从牦牛酸奶样品中分离纯化出的一株乳酸菌，革兰氏染色呈现阳性。该乳酸菌的菌落形态见图1，100倍油镜下，菌株革兰氏染色后的细胞形态图见图2。由图1可知，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。由图2可知，细胞形态有长杆、短杆、球状，且不存在出芽生殖。
45.pcr扩增产物序列如seq id no.3所示，并经blast程序比对分析表明，筛选菌株为lactobacillus plantarum，且与gene bank数据库(登录号为mn368282.1)中已知乳酸菌的同源性均达99％以上。
46.通过形态学观察和16s rdna种属分析可筛选菌株鉴定为植物乳酸杆菌lactobacillus plantarum，命名为hyf15，并于2018年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.16648。
47.实施例2：菌株通过pth通路促进钙吸收
48.一、菌株和实验动物
49.将植物乳杆菌hyf15接种于mrs液体培养基中复苏纯化，置于37℃，100rpm恒温摇床内培养24h，用40％甘油将第一代菌液进行1:1保藏在超低温冰箱(-80℃)中备用。
50.实验动物为3-4周龄断乳c57bl/6小鼠，雄性，60只。小鼠置于室温保持在25
±
2℃，空气相对湿度50
±
5％，12h光/12h暗交替的标准化实验室。在开始进行喂养实验前，小鼠在实验室条件下适应一周，期间饲喂ain93标准饲料，自由饮用去离子水。
51.适应饲养一周后，随机分为6组，分别是标准组、模型组、碳酸钙组(对照组)、钙+vitamin d组(钙+vd组)、植物乳杆菌hyf15组(菌组)、hyf15+碳酸钙组(菌+钙组)，每组10只小鼠。
52.标准组饲喂ain93标准饲料，每日自由饮水；模型组饲喂ain93低钙饲料，每日灌胃等体积去离子水；对照组饲喂ain93低钙饲料，每日灌胃碳酸钙溶液；菌组饲喂ain93低钙饲料，每日灌胃菌hyf15溶液(1.0
×
109cfu/kg)；菌+钙组饲喂ain93低钙饲料，每日灌胃菌hyf15溶液+碳酸钙溶液。实验周期(8周)结束后，所有小鼠禁食禁水24h，然后用颈椎脱位处死。通过眼球收集全血，在4℃冰箱静置2h左右，于4000r/min条件下离心10min，取上层血清，进行适量分装后存放于-80℃冰箱，直到进一步使用。实时荧光定量pcr检测pth通路相关基因表达水平。酶联免疫吸附测定证实基因表达结果。此外，测定血钙、血磷，并收集胫骨
和股骨，用10％(v/v)缓冲甲醛固定，进行组织学分析和显微ct(micro-ct)。部分股骨测定干重及骨钙含量。
53.实验过程中所用ain93标准饲料为ain93-标椎g，ain93低钙饲料为ain93-低钙g。
54.二、指标测定
55.1、小鼠血清中钙、磷的测定
56.通过样品中钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝(mtb)结合，生成蓝色络合物；通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出小鼠血清中钙的含量。
57.样品中的无机磷与钼酸作用生成磷钼酸，后者被还原成钼蓝，在660nm处有最大吸收峰，通过比色可以计算出小鼠血清中p的含量。
58.2、小鼠血清中激素水平的测定
59.以小鼠血清为样本，按照elisa说明书，测定小鼠血清中生长激素碱性磷酸酶(alp/akp)、小鼠骨碱性磷酸酶(balp)、小鼠骨钙素(bgp；ocn)、小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)、小鼠甲状旁腺激素(pth)、小鼠1,25-二羟基维生素d3(1,25(oh)2d3)的水平。
60.3、小鼠小肠pth通路相关基因的mrna表达
61.运用实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)，根据revert aid first strand cdna合成试剂盒说明书将rna反转录成cdna，配制含1μl cdna的反应体系，最后将得到的cdna密封保存于-80℃冰箱备用。然后采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative pcr detecting system，qpcr)对合成的dna的数量进行实时定量检测，试剂包括10μl sybr green pcr master mix、上下游各1μl引物溶液和7μl无菌超纯水。在step one plus real-time pcr仪中进行扩增检测，扩增条件为95℃变性3min，60℃退火20s，95℃延伸1min，整个过程进行40次循环，最后在条件95℃，30s；55℃，35s下进行检测。选择β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，根据公式2-δδct计算各目的基因的mrna相对表达量并进行分析，通过内参或外参法对待测样品中pth、pthr、gs、ac、pka以及β-action进行定量分析。
62.4、小鼠骨相关数据
63.运用电子计算机断层扫描(computed tomography，ct)技术对不同实验小组的小鼠胫骨和股骨进行分析，计算所获得ct图的骨密度、骨体积、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁分离程度以及组织体积数据。
64.三、结果和分析
65.1、小鼠体重
66.实验期间小鼠的生长发育状况良好，活动正常，未出现任何异常现象。动物外观、体征、饮食、粪便活动均正常。如表1所示，模型组小鼠体重增长率最高，较除标准组外其他处理组差异较显著(p＜0.05)，对照组与ca+vd组增长率无显著差异(p＞0.05)，菌+ca组增长率略微高于菌组。
67.表1实验小鼠体重情况
[0068][0069]
2、血清中钙吸收相关因子水平结果
[0070]
如表2所示，相较于模型组，其余各组血钙水平均有一定程度的提高，各处理组之间血钙水平含量无显著差异(p＞0.05)；其中模型组血磷水平最高，其余各组间血磷水平无显著差异但均大于标准组血磷水平。碱性磷酸酶(alp)在模型水平明显较其他组有所降低；甲状旁腺激素(pth)水平在模型组和对照组中均有所降低，其余组之间pth含量无显著差异(p＞0.05)。
[0071]
如图表3所示，小鼠1,25-二羟基维生素d3(1,25(oh)2d3)含量在菌组和菌+ca组均有降低；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(trar)含量在ca+vd组、菌组和菌+ca组均有所提升，但并不显著，标准组、模型组与对照组中含量大致相同；小鼠骨碱性磷酸酶(balp)含量在处理组均有不同程度的降低，其中菌+ca组降低程度最高；小鼠骨钙素(bgp)含量在对照组、ca+vd组、菌组均有一定程度提升，但在菌+ca组有小幅降低。
[0072]
表2血清中钙吸收相关因子水平结果
[0073][0074]
表3血清中钙吸收相关因子水平结果
[0075][0076][0077]
3、pth通路相关基因mrna表达结果
[0078]
pth、pthr、gs、ac和pka相对表达量结果分别见表4、图3至图8。由表4、图3至图4可知，除模型组外其他组在pth和pthr相对表达量上与对照组相比均有不同幅度的提升，其中，菌处理组的pth和pthr相对表达量高于除标准组外的其他处理组，这表明菌hyf15可以促进pth和pthr在pth通路中的表达；处理组的gs和ac相对表达量均高于模型组但小于标准组；pka在各组中相对表达量无显著差异(p＞0.05)。除对照组和模型组外，其他各组之间β-action相对表达量无显著差异(p》0.05)。从上述结果可以看出，菌hyf15可以促进与pth通路相关基因的mrna的表达，这意味着植物乳杆菌hyf15对低钙模型小鼠的钙吸收具有一定的促进作用。
[0079]
表4pth通路相关基因mrna表达强度
[0080][0081]
4、小鼠骨相关数据结果
[0082]
图9为小鼠骨相关数据结果，其中，每组柱状图从左到右分别为骨密度、骨体积、骨小梁厚度和骨小梁分离程度。图10为小鼠骨小梁数据结果。
[0083]
表5为骨密度、骨体积、骨小梁厚度和骨小梁分离程度结果；表6为骨小梁数据和组织体积结果。
[0084]
表5骨密度、骨体积、骨小梁厚度和骨小梁分离程度
[0085][0086]
表6骨小梁数和组织体积
[0087][0088]
由表5和表6、图9和图10可知，处理组骨密度和骨体积较模型组均有一定幅度提升，其中菌+ca组提升幅度最大；各组骨小梁厚度无显著差异(p＞0.05)，骨小梁分离程度与其他数据无线性相关；标准组骨小梁数最高，其余处理组均高于模型组。如图11所示，除标准组和模型组外，各组之间组织体积无显著差异(p＞0.05)。从上述结果可以得出结论：植物乳杆菌hyf15对小鼠骨发育具有一定的促进作用。
[0089]
本发明通过低钙饲料诱导构建小鼠低钙模型，探究了植物乳杆菌hyf15通过pth通路对小鼠钙吸收的影响，得出如下结论：
[0090]
(1)植物乳杆菌hyf15可以有效促进小鼠血清中的钙磷平衡，提高碱性磷酸酶alp的水平，从而促进小鼠的骨发育和营养摄入。
[0091]
(2)通过elisa实验数据得出，灌胃植物乳杆菌hyf15组的小鼠并未通过提高小鼠血清中与骨发育相关的物质水平来促进钙吸收和骨形成。
[0092]
(3)通过qpcr实验结果得出，植物乳杆菌hyf15可以通过提高小鼠小肠中pth和pthr的水平来激活gs/camp/pka信号通路，并促进小鼠小肠中pth通路相关基因中mrna的表达，从而提高小鼠机体对钙的吸收。
[0093]
(4)由骨相关ct数据可以得出，植物乳杆菌hyf15可以促进小鼠骨密度和骨体积的提高，改善小鼠骨小梁的发育。
[0094]
综上，植物乳杆菌hyf15可以通过调节小肠中pth信号通路相关的pth、pthr、gs、
ac、pka基因水平来激活gs/camp/pka信号通路，从而促进小鼠对钙的吸收，改善小鼠因缺钙而导致的骨发育不良。本发明研究结果证实了植物乳杆菌hyf15通过pth通路对小鼠钙吸收造成积极的影响，且植物乳杆菌hyf15+ca对gs/camp/pka信号通路的激活作用更显著，这可能与小肠中pth和pthr的合成有关。
[0095]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。