一种固定化脂肪酶及其应用的制作方法

1.本发明属于酶固定化领域，涉及一种固定化脂肪酶及其应用，尤其是在维生素a棕榈酸酯制备中的应用。


背景技术：

2.脂肪酶存在于自然界各种动植物和微生物体内，可催化水解、酯化、酰胺化等化学反应。同时其在有机相也表现出高效的催化活性，这拓宽了该酶的应用领域。脂肪酶经过固定化之后有利于酶重复使用，进而降低脂肪酶的使用成本。因此脂肪酶的固定化效果是影响脂肪酶酶活性与回用次数的重要因素。影响脂肪酶固定化的最重要因素是固定化过程中酶分子更倾向于聚集很难以单分子层的形式存在而导致固定化过程大部分酶分子没有与载体结合，从而影响固定化效率。另一因素是固定化时间较长，在这一过程中蛋白质分子的结构易遭到破坏而影响酶的活性。
3.现有方法在固定化过程中加入了triton x-100等化学表面活性剂，从而使酶分子形成单分子层。但是由于triton x-100是一种醚类化合物，可能对蛋白质的分子结构有一定破坏作用。同时如何保证酶在固定化过程中的稳定性，目前研究较少。因此，开发出生物基表面活性剂和酶结构稳定剂是保证脂肪酶高效固定的必要条件。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高效固定化脂肪酶并表征其在维生素a棕榈酸酯合成中的应用。具体来说，本发明的固定化脂肪酶的制备方法中添加微藻来源的生物基共固定化剂和葡萄苷物质，分别提高了酶在体系中的分散均匀度和维持了酶结构稳定性，从而提高了脂肪酶的固定化效率和脂肪酶活性，本发明的操作简单，将本发明的固定化脂肪酶应用于维生素a棕榈酸酯合成反应中反应转化率高。
5.为实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种固定化脂肪酶，其通过在缓冲溶液中加入游离脂肪酶、固定化载体、稳定剂和生物来源的共固定化剂，在适合所述固定化载体吸附所述游离脂肪酶的条件下搅拌，然后将所得的溶液经过滤、清洗和干燥后制得。
6.在本发明的一个实施方案中，上述固定化脂肪酶中，所述游离脂肪酶选自米黑根毛霉(rhizomucor miehei)来源游离脂肪酶、柔毛腐质霉(humicola lanuginosa)来源游离脂肪酶和南极假丝酵母(candida antarctica)来源游离脂肪酶的一种或多种，优选米黑根毛霉来源游离脂肪酶。这些游离脂肪酶可以是商购的，也可以是自制的。在本领域中，这些游离脂肪酶的制备方法是公知的，可以采用任何一种现有的方法进行制备，例如可以通过如下方法制备：将菌液接种到含基础盐的培养基中进行发酵，在溶氧上升时，流加甘油，间歇补料酵母膏和蛋白胨，控制溶氧和ph，发酵结束后离心收集上清并冻干。
7.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述共固定化剂来源于微藻藻油纯化后的极性糖脂混合物，其制备方法包括如下步骤:
8.(1)取微藻生物质加入有机溶剂，于20～50℃(例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃和50℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选35～50℃条件下混合均匀，调节体系压力至10～40mpa(例如10mpa、20mpa、30mpa和40mpa，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选30～40mpa，搅拌2～5h(例如2h、3h、4h和5h)，优选3～5h，使得微藻生物质破碎；搅拌完成后离心取上清液，离心转速为5000～10000rpm(例如5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm和10000rpm，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选8000～10000rpm，得到粗藻油；将所述上清于3～10kpa，优选3～8kpa、45-55℃条件下脱除溶剂，得到藻油固体；
9.(2)将藻油固体经过硅胶柱分离，洗脱溶剂为正庚烷:异丙醇＝(4-10):1(v/v)(例如4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选(8～10):1；收集1cv(柱体积)至2～3cv(例如1至2cv，1至2.5cv和1至3cv)，优选1至2.5～3cv(柱体积)组分；将所得组分于3～10kpa(例如3kpa、4kpa、5kpa、6kpa、7kpa和8kpa，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选3～8kpa、45-55℃条件下脱除溶剂后即为共固定化剂。
10.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述共固定化剂的制备方法中，
11.步骤(1)中，所述微藻生物质为微藻干藻粉，优选选自螺旋藻干藻粉、小球藻干藻粉和三角褐指藻干藻粉中的一种或多种，更优选三角褐指藻干藻粉；和/或
12.步骤(1)中，所述有机溶剂选自甲醇、氯仿、正己烷中的一种或多种，优选甲醇；优选地，步骤(1)中，每克微藻生物质中加入有机溶剂的体积为5～10ml(例如5ml、6ml、7ml、8ml、9ml和10ml，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选8～10ml；和/或
13.步骤(2)中，所述藻油固体与所述硅胶的质量比为1:(40～100)(例如1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选1:(40～70)；
14.硅胶柱的柱内径例如可以为72～100mm。
15.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述稳定剂选自甲基葡萄糖苷、乙基葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷中的一种或多种，优选甘油葡萄糖苷。
16.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述固定化载体为吸附树脂，优选d3520、duolite a568和amberlite x.a.d 761材料中的一种或多种，更优选duolite a568。
17.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述缓冲溶液选自tris-盐酸缓冲液、bis-tris-盐酸缓冲液中的一种或多种，优选tris-盐酸缓冲液；浓度为0.5～2.0mol/l(例如0.5mol/l、1mol/l、1.3mol/l、1.7mol/l、1.9mol/l和2.0mol/l，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选0.5～1mo1/l；ph为5～8(例如5，6，7和8)，优选6～8。
18.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述缓冲溶液的加入量为每克游离脂肪酶加入的缓冲溶液的体积为200～300ml(例如200ml、210ml、220ml、230ml、240ml、250ml、260ml，270ml、280ml、290ml和300ml)，优选250～300ml；所述共固定化剂与所述稳定剂在缓冲溶液中的质量分数分别为0.5～3％和0.1～1％，分别优选0.5～1.5％和0.1～0.5％；
19.所述游离脂肪酶与所述固定化载体的质量比为：1:(8～10)，优选1:(8～9)；
20.所述脂肪酶固定化条件为：温度20～50℃(例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选25～35℃；搅拌转速50～100rpm(例如50rpm、80rpm、100rpm)，优选50～80rpm；搅拌时间12～24h(例如12h、14h、16h，18h和20h)，优选16～24h。
21.在本发明的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，过滤与清洗为常规操作，例如用滤纸过滤和用所述缓冲溶液清洗，且干燥为室温自然干燥，例如20-25℃下干燥。
22.在另一方面，本发明提供上述任一所述的固定化脂肪酶在催化合成维生素a棕榈酸酯中的应用。
23.在又一方面，本发明提供一种维生素a棕榈酸酯的酶法合成方法，包括使用上述任一所述的固定化脂肪酶为催化剂，催化原料维生素a醋酸酯和棕榈酸反应生成维生素a棕榈酸酯的步骤。
24.在本发明的一个实施方案中，上述维生素a棕榈酸酯的酶法合成方法中，所述维生素a醋酸酯和棕榈酸的摩尔比为1:(1～1.2)(例如1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15、1:1.16、1:1.17、1:1.18、1:1.19、1:1.2，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选1:(1.1～1.15)；所述固定化脂肪酶与所述维生素a醋酸酯的质量比为1:(40～100)(例如1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选1:(40～60)；反应溶剂为正己烷、正庚烷和正辛烷中的一种或多种，优选正辛烷；所述反应的温度为30～60℃(例如35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃)，优选30～45℃，时间为6～10h(例如6h、7h、8h、9h和10h)，优选8～10h。
25.本发明的有益效果在于：
26.本发明提供一种高活性的脂肪酶固定化方法，微藻藻油分离提取物主要以极性糖脂为主，其化学结构中具有亲水和疏水双亲性质，可以作为生物基共固定化剂，其一方面可以与酶分子有很好的生物相容性，另一方面可以保证酶分子在固定化过程中呈单分子层形态，从而提高了酶固定化效率；并减少使用过程中酶脱附现象的出现，提高酶回用次数；固定化过程中加入葡萄糖苷类物质可以进一步维持脂肪酶的活性，使其在固定化过程中不易失活，更好地保证其催化效果。
27.本发明的方法操作简单，蛋白吸附率和脂肪酶活性均较高，分别高达99.2％和11038u/g，应用于维生素a棕榈酸酯合成反应中，具有较高的转化率，可以高达99.6％，在套用过程中酶也保持较好的稳定性，有很大的工业化应用的潜力。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
29.螺旋藻干藻粉、小球藻干藻粉和三角褐指藻干藻粉分别为山东博然螺旋藻生物股份有限公司、济南圣和化工有限公司和上海光语生物科技有限公司产品。
30.米黑根毛霉(rhizomucor miehei)来源游离脂肪酶、柔毛腐质霉(humicola lanuginosa)来源游离脂肪酶和南极假丝酵母(candida antarctica)来源游离脂肪酶分别采用米黑根毛霉、柔毛腐质霉和南极假丝酵母通过如下方法发酵生产：
31.将菌液(od600＝20～40)按10％(v/v)接种量接种至含基础盐培养基(1g/l硫酸钙，18g/l硫酸钾，15g/l硫酸镁，4.2g/l氢氧化钾，2.7％(v/v)磷酸，4％(v/v)甘油)的100l发酵罐中，温度30℃，转速800rpm，通气量为8l/min；当溶氧上升至35％时，流加60％(v/v)甘油，流速约为2ml/(min
·
l)，时间为6～8h；每隔12h补加酵母膏和蛋白胨，酵母膏的加入量为1％(w/v，g/100ml)，蛋白胨的加入量为1.5％(w/v，g/100ml)；通过调节通气量使溶氧控制在20％～30％范围内，通过流加氨水控制ph在5.5左右；培养140h后，于4℃，12000rpm条件下离心5min收集发酵液上清，冻干备用。
32.吐温80、triton x-100、甲基葡萄糖苷、乙基葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷均为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品。
33.分析标准品sqdg(硫代异鼠李糖二酰基甘油酯)、mgdg(单半乳糖二酰基甘油酯)和dgdg(双半乳糖二酰基甘油酯)均为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品。
34.硅胶、d3520(离子交换大孔吸附树脂)、duolite a568(弱碱性酚醛系阴离子交换树脂)和amberlite x.a.d 761(离子交换大孔吸附树脂)均为西安蓝晓科技新材料股份有限公司产品。
35.维生素a醋酸酯晶体为浙江医药股份有限公司产品。
36.棕榈酸为阿拉丁公司产品。
37.固定化脂肪酶novozym 435为诺维信公司产品。
38.下述实施例采用的分析测试方法如下：
39.1)极性糖脂混合物检测与定量：
40.a.分别用甲醇配制sqdg(硫代异鼠李糖二酰基甘油酯，0～200ppm)、mgdg(单半乳糖二酰基甘油酯，0～200ppm)和dgdg(双半乳糖二酰基甘油酯，0～200ppm)的标准溶液。
41.b.分别取约1mg共固定化剂制备极性糖脂混合物样品(质量计为m)，加入适量甲醇复溶进行分析检测定量。
42.c.采用高效液相色谱仪，安捷伦lc-1200，色谱柱：hilic柱(4.6mm
×
150mm，3.5μm，xbridge，waters，usa)，柱温：30℃，检测器为elsd。流动相a为乙腈:水(95:5v/v，2.5mm甲酸铵，0.02％甲酸)；流动相b为乙腈:水(50:50v/v，2.5mm甲酸铵，0.02％甲酸)。初始流动相为100％a，随后在20min内线性变动至50％a，然后1min内回到初始流动相并保持6min，流速：1ml/min，上样量：10μl。mgdg、dgdg的sqdg的保留时间分别为6.4min、11.8min和16.4min。
43.d.根据标准曲线和样品中sqdg、mgdg和dgdg的峰面积计算相应物质浓度并计算各物质占极性糖脂混合物的比例(c
折算
*v/m*100％，其中，c
折算
为sqdg、mgdg和dgdg分别依据标准曲线换算后的浓度，单位为mg/l；v为样品稀释后的总体积，单位为l；m为所取的极性糖脂混合物的总质量，单位为mg)。总质量百分含量为三者比例之和。
44.2)蛋白质含量及蛋白吸附率检测
45.蛋白质含量采用碧云天bca蛋白浓度测定试剂盒检测。
46.蛋白吸附率计算公式为：(x
1-x2)/x1*100％，其中，x1为吸附前(即加入缓冲液之后，加入树脂、葡萄糖苷和共固定化剂前)酶液中蛋白含量，单位为mg/ml；x2为吸附后(即加
入树脂、葡萄糖苷和共固定化剂搅拌反应后)酶液中蛋白含量，单位为mg/ml。
47.3)酶活检测
48.a.取320μl水、8g月桂酸和2.4g正丙醇于50ml锥形瓶中，于恒温摇床(60℃，200rpm)预热10min后，加入约30mg固定化脂肪酶(质量计为m)。
49.b.于60℃，200rpm条件下继续反应20min，取样并用正庚烷经过适当稀释后用于酶活检测。
50.c.分别用正庚烷配制月桂酸(0～30mm)、正丙醇(0～30mm)和月桂酸丙酯(0～7.5mm)标准溶液；样品采用气相色谱仪：安捷伦gc7890b，毛细管柱：restek stabilwax da柱(15m
×
0.25mm，0.25μm)，fid检测器进行检测。进样量为1μl，载气为氮气，流速为2ml/min。进样器温度为280℃，检测器温度为280℃，升温程序：
51.0～2min：60℃
52.2～6min：60-260℃，升温50℃/min
53.6～8min：250℃
54.气相色谱会将正丙醇、月桂酸丙酯和月桂酸分离，对应的保留时间分别为1.2min，5.1min和6.8min。
55.d.根据标准曲线和样品中正丙醇、月桂酸丙酯和月桂酸的峰面积计算相应物质浓度并计算月桂酸转化率(c＝(a
1-a2)/a1*100％，其中，a1为反应前(即预热后，加入固定化脂肪酶前)月桂酸的浓度，单位为mm；a2为反应后月桂酸的浓度，单位为mm)。
56.e.酶活计算公式为：酶活(u/g)＝n*c/(20*m)；其中，n为初始加入月桂酸的摩尔数，单位为μmol；c为月桂酸的转化率；20为反应时间，单位为min；m为固定化酶质量，单位为g。定义在标准反应条件下每分钟生成1μmol的月桂酸丙酯所需要的酶量为1u。
57.4)维生素a棕榈酸酯反应检测
58.a.分别用甲醇配制维生素a醋酸酯(0～1000ppm)和维生素a棕榈酸酯(0～1000ppm)标准溶液。
59.b.取维生素a棕榈酸酯合成反应后样品用甲醇经过适当稀释后备用。
60.c.将样品与标准溶液样品于高效液相色谱仪检测。仪器型号为安捷伦lc-1200，色谱柱：agilent sb-aq(4.6
×
250mm，5μm)，检测波长为326nm；检测温度：40℃；流动相：异丙醇:水＝95:1(v/v)；流速1ml/min；上样量2μl。其中维生素a醋酸酯和维生素a棕榈酸酯的保留时间分别为12.6min和26.4min。
61.d.根据标准曲线和样品中维生素a醋酸酯和维生素a棕榈酸酯的峰面积计算相应物质浓度并计算维生素a醋酸酯转化率(c＝(a
1-a2)/a1*100％，其中，a1为反应前(即维生素a醋酸酯中加入正辛烷或正己烷或正庚烷等反应溶剂和棕榈酸之后，加入固定化脂肪酶之前)维生素a醋酸酯的浓度，单位为ppm；a2为反应后维生素a醋酸酯的浓度，单位为ppm)。
62.实施例1：共固定化剂的制备
63.螺旋藻来源共固定化剂-共固定化剂a：
64.(1)螺旋藻藻油固体的制备：称取300g螺旋藻干藻粉，加入至5l不锈钢耐压反应釜中，向其中加入2.4l正己烷，缓慢升温至35℃，调整体系压力至10mpa，搅拌3h。搅拌完成后将物料于8000rpm条件下离心，获得上清，即粗藻油。将所得上清在4kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到藻油固体，称重约32.4g。
65.(2)目的洗脱组分的收集：称取约800g硅胶，并用3l正庚烷:异丙醇＝4:1(v/v)混合溶液混合搅拌至无气泡，灌装分离柱(玻璃层析柱内径为72mm，有效柱体积为3.3l)，柱体积约2.4l。取步骤(1)中的藻油固体20g，用20ml正庚烷:异丙醇＝4:1(v/v)混合溶液复溶，上样于灌装分离柱中。并用正庚烷:异丙醇＝4:1(v/v)混合溶液洗脱，记录收集组分体积，将对应的洗脱体积2.4～4.8l所得组分合并，并于4kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到共固定化剂a，称重约7.8g。
66.经高效液相色谱检测定量后，共固定化剂a中极性糖脂总质量百分含量为99.3％，其中mgdg为52.2％，dgdg为24.0％，sqdg为23.1％。
67.小球藻来源共固定化剂-共固定化剂b：
68.(1)小球藻藻油固体的制备：称取300g小球藻干藻粉，加入至3l不锈钢耐压反应釜中，向其中加入1.5l氯仿，保持温度20℃，调整体系压力至30mpa，搅拌5h。搅拌完成后将物料于10000rpm条件下离心，获得上清，即粗藻油。将所得上清在8kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到藻油固体，称重约63.5g。
69.(2)目的洗脱组分的收集：称取约1400g硅胶，并用5l正庚烷:异丙醇＝8:1(v/v)混合溶液混合搅拌至无气泡，灌装分离柱(玻璃层析柱内径为92mm，有效柱体积为6.6l)，柱体积约4.2l。取步骤(1)中的藻油固体20g，用20ml正庚烷:异丙醇＝8:1(v/v)混合溶液复溶，上样于灌装分离柱中。并用正庚烷:异丙醇＝8:1(v/v)混合溶液洗脱，记录收集组分体积，将对应的洗脱体积4.2～10.5l所得组分合并，并于8kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到共固定化剂b，称重约9.7g。
70.经高效液相色谱检测定量后，共固定化剂b中极性糖脂总质量百分含量为99.4％，其中mgdg为54.7％，dgdg为22.6％，sqdg为22.1％。
71.三角褐指藻来源共固定化剂-共固定化剂c：
72.(1)三角褐指藻藻油固体的制备：称取300g三角褐指藻干藻粉，加入至5l不锈钢耐压反应釜中，向其中加入3l甲醇，缓慢升温至50℃，调整体系压力至40mpa，搅拌2h。搅拌完成后将物料于5000rpm条件下离心，获得上清，即粗藻油。将所得上清在3kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到藻油固体，称重约79.8g。
73.(2)目的洗脱组分的收集：称取约2000g硅胶，并用7l正庚烷:异丙醇＝10:1(v/v)混合溶液混合搅拌至无气泡，灌装分离柱(玻璃层析柱内径为100mm，有效柱体积为9.4l)，柱体积约6l。取步骤(1)中的藻油固体20g，用20ml正庚烷:异丙醇＝10:1(v/v)混合溶液复溶，上样于灌装分离柱中。并用正庚烷:异丙醇＝10:1(v/v)混合溶液洗脱，记录收集组分体积，将对应的洗脱体积6～18l所得组分合并，并于3kpa、50℃条件下脱除溶剂，待溶剂完全脱除后，得到共固定化剂c，称重约11.6g。
74.经高效液相色谱检测定量后，共固定化剂c中极性糖脂总质量百分含量为99.5％，其中mgdg为56.1％，dgdg为23.1％，sqdg为20.3％。
75.实施例2：脂肪酶固定化
76.脂肪酶固定化-酶a
77.称取1g南极假丝酵母(candida antarctica)来源游离脂肪酶，加入200ml 2mol/l，ph5.0的bis-tris-hcl缓冲液，然后分别加入10g d3520树脂、2g甲基葡萄糖苷和6g共固定化剂a，于50℃、100rpm条件搅拌12h。搅拌结束后溶液过滤，并用2mol/l，ph5.0的
bistris-hcl缓冲液清洗一次树脂，将树脂自然干燥，得到固定化脂肪酶a。
78.经检测，蛋白吸附率为98.5％，固定化脂肪酶a的活性为10653u/g。
79.脂肪酶固定化-酶b
80.称取1g柔毛腐质霉(humicola lanuginosa)来源游离脂肪酶，加入300ml 1mol/l，ph8.0的tris-hcl缓冲液，然后分别加入9g amberlite x.a.d 761树脂、0.3g乙基葡萄糖苷和1.5g共固定化剂b，于20℃、80rpm条件搅拌16h。搅拌结束后进行溶液过滤，并用1mol/l，ph8.0的tris-hcl缓冲液清洗一次树脂，将树脂自然干燥，得到固定化脂肪酶b。
81.经检测，蛋白吸附率为98.8％，固定化脂肪酶b的活性为10846u/g。
82.脂肪酶固定化-酶c
83.称取1g米黑根毛霉(rhizomucor miehei)来源游离脂肪酶，加入250ml 0.5mol/l，ph6.0的tris-hcl缓冲液，然后分别加入8g duolite a568树脂、1.25g甘油葡萄糖苷和3.75g共固定化剂c，于35℃、50rpm条件搅拌24h。搅拌结束后进行溶液过滤，并用0.5mol/l，ph6.0的tris-hcl缓冲液清洗一次树脂，将树脂自然干燥，得到固定化脂肪酶c。
84.经检测，蛋白吸附率为99.2％，固定化脂肪酶c的活性为11038u/g。
85.实施例3：维生素a棕榈酸酯的合成与脂肪酶回用
86.用氮气置换三口瓶内空气，准确称取维生素a醋酸酯10g置于250ml三口瓶中，加入100ml正辛烷、8.59g棕榈酸、0.25g固定化脂肪酶a，35℃条件下，搅拌反应10小时。反应结束后检测反应中维生素a醋酸酯的转化率为99.6％。
87.反应结束后，将反应体系过滤得到固定化脂肪酶a，按上述反应物的配比加入反应体系，将回收的固定化脂肪酶a再加入反应体系中，相同条件下重复套用20次，反应转化率(即维生素a醋酸酯的转化率)如表1所示。
88.表1固定化脂肪酶a套用20次后反应效果
[0089][0090]
如表1所示，固定化脂肪酶a套用20次仍然保持较高的催化活性，表明脂肪酶活性稳定。
[0091]
实施例4：维生素a棕榈酸酯的合成
[0092]
用氮气置换三口瓶内空气，准确称取维生素a醋酸酯10g置于250ml三口瓶中，加入100ml正己烷、8.98g棕榈酸、0.17g固定化脂肪酶b，45℃条件下，搅拌反应8小时。反应结束后检测反应中维生素a醋酸酯的转化率为99.5％。
[0093]
实施例5：维生素a棕榈酸酯的合成
[0094]
用氮气置换三口瓶内空气，准确称取维生素a醋酸酯10g置于250ml三口瓶中，加入100ml正庚烷、9.37g棕榈酸、0.1g固定化脂肪酶c，60℃条件下，搅拌反应6小时。反应结束后检测反应中维生素a醋酸酯的转化率为99.4％。
[0095]
对比例1
[0096]
参照实施例2中“脂肪酶固定化-酶c”的方法制备固定化脂肪酶d，不同之处仅在于：不添加共固定化剂c，其它操作相同。经检测蛋白吸附率为82.1％，酶活为7964.8u/g。
[0097]
参照实施例5的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶c替
换为等质量的固定化脂肪酶d，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为78.5％。
[0098]
对比例2
[0099]
参照实施例2中“脂肪酶固定化-酶c”的方法制备固定化脂肪酶e，不同之处仅在于：不添加甘油葡萄糖苷，其它操作相同。经检测，蛋白吸附率为97.8％，酶活为9893.8u/g。
[0100]
参照实施例5的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶c替换为等质量的固定化脂肪酶e，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为95.2％；进行脂肪酶套用实验，发现套用至第5次时，维生素a醋酸酯的转化率降至68.9％。
[0101]
对比例3
[0102]
参照实施例2中“脂肪酶固定化-酶c”的方法制备固定化脂肪酶f，不同之处仅在于：不添加共固定化剂c和甘油葡萄糖苷，其它操作相同。经检测，蛋白吸附率为81.2％，酶活为7058.2u/g。
[0103]
参照实施例5的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶c替换为等质量的固定化脂肪酶f，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为70.6％。
[0104]
对比例4
[0105]
参照实施例2中“脂肪酶固定化-酶c”的方法制备固定化脂肪酶g，不同之处仅在于：将共固定化剂c替换为等质量的triton x-100，其它操作相同。经检测，蛋白吸附率为86.3％，酶活为8961.4u/g。
[0106]
参照实施例5的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶c替换为等质量的固定化脂肪酶g，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为88.2％。
[0107]
对比例5
[0108]
参照实施例2中“脂肪酶固定化-酶c”的方法制备固定化脂肪酶h，不同之处仅在于：将共固定化剂c替换为等质量的吐温80，其它操作相同。经检测，蛋白吸附率为87.2％，酶活为9061.3u/g。
[0109]
参照实施例5的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶c替换为等质量的固定化脂肪酶h，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为89.7％。
[0110]
对比例6
[0111]
参照实施例3的方法制备维生素a棕榈酸酯，不同之处仅在于：将固定化脂肪酶a替换为等质量的商品化脂肪酶novozym 435，其它操作相同。反应结束后检测维生素a醋酸酯的转化率为98.4％；进行脂肪酶套用实验，发现套用至第5次时，维生素a醋酸酯的转化率降至86.9％。
[0112]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。