一种全新枯草芽孢杆菌及其在人工熊胆粉全细胞转化中的应用的制作方法

本发明涉及一种全新枯草芽孢杆菌及其在人工熊胆粉全细胞转化中的应用，属于食品和生物医药领域。

背景技术：

1、熊胆粉，具有清热解毒、平肝明目、消除炎症，溶解胆结石等功效，由熊科动物的胆汁经干燥而来，熊科动物的胆汁经干燥过便于长期保存。熊胆粉的主要特征性药效成分是牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，tudca)和以一定比例存在的牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid，tcdca)，二者的比例通常在1.0～1.5之间。天然tudca仅存在于熊科动物的胆汁中，而tcdca广泛存在于家禽的胆汁酸中，二者的区别在于7位羟基的空间构型不同。

2、相对而言，含有高浓度tcdca的禽胆粉的获得就容易的多。2019年全国仅白羽鸡的产量就高达44亿只。大量的鸡胆被当做不可食用的垃圾处理。另外，7α-羟基类固醇脱氢酶(指7α-hydroxysteroid dehydrogenase，7α-hsdh或5α、12α等同功酶)和7β-羟基类固醇脱氢酶(指7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-hsdh或5β、12β等同功酶)被发现均具有双向氧化还原活性，可以通过两步反应实现7位羟基的差向异构化。

3、为解决天然熊胆粉短缺的问题，弥补熊胆粉市场的不足，也为了将鸡胆变废为宝，利用酶催化法将禽畜胆中的牛磺鹅去氧胆酸转化成牛磺熊去氧胆酸的方法应运而生。

4、专利cn112779175a披露了一种制备人工熊胆粉的工程酿酒酵母及方法，采用同时表达 7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hsdh)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hsdh)基因的酿酒酵母进行液体培养后，制备粗酶提取物，直接将家禽胆汁制品如禽胆粉中牛磺鹅去氧胆酸转化为一定比例的牛磺熊去氧胆酸。但是，这种方法在工业化大规模生产时面临着很多难题。譬如，制备粗酶提取物时，需要将工程酵母菌株进行破碎，再以过滤的方式来获得酶悬液。然而，超声破

5、碎只适合实验室几十毫升级别的小规模细菌破碎，高压破碎的压力高达800-1200bar，很难找到合适的高压设备做大批量的菌体破碎。同时，酵母的表达周期时长通常为细菌的4-5 倍，时间的延长也意味着相应的成本增加。cn 104382941 b公布了一种通过固定化酶技术来实现双酶对禽胆粉的生物转化。该方法虽然具备一定的可行性，但制备固定化酶之前先要对需要固定化的酶进行纯化，而纯化的费用通常非常高昂，使得人工熊胆粉制备的成本大大提高。同时该固定化酶的方法还有不同批次间的一致性和稳定性差等缺点，所以该方法不适合规模化放大。

技术实现思路

1、针对目前存在的问题，本发明在枯草芽孢杆菌中表达了7α-羟基类固醇脱氢酶(或5α、 12α等同功酶)和7β-羟基类固醇脱氢酶(或5β、12β等同功酶)。通过将7α-hsdh羟基类固醇脱氢酶和7β-hsdh羟基类固醇脱氢酶基因重组于表达质粒pwb980、php13-p43、pht254、pp43nmk上。并在7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶编码基因之前连接一段热激蛋白hsp的序列进行融合表达，采用温度调控促进宿主细胞生产蛋白，所述宿主细胞包括食品级安全菌株枯草芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168、bacillussubtilis wb400、 bacillus subtilis wb600、bacillus subtilis wb800、bacillussubtilis 1012等，将培养得到的菌体细胞直接用于转化鸡胆粉生成人工熊胆粉，制备得到人工熊胆粉安全无毒害、可直接应用于食品和药品领域。

2、本发明的第一个目的是提供一种可转化生产人工熊胆粉的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌中表达了7α-羟基类固醇脱氢酶或7β-羟基类固醇脱氢酶。

3、在一种实施方式中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶前面还含有热激蛋白的部分氨基酸序列，所述氨基酸序列如seq id no.5所示。

4、在一种实施方式中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶或7β-羟基类固醇脱氢酶通过pwb980、 php13-p43、pht254、pp43nmk质粒进行表达。

5、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌bacillussubtilis 168、 bacillus subtilis wb400、bacillus subtilis wb600、bacillussubtilis wb800、bacillus subtilis 1012。

6、本发明的第二个目的是提供含有所述重组枯草芽孢杆菌的产品。

7、在一种实施方式中，所述产品为包含所述重组枯草芽孢杆菌的微生物制剂。

8、在一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法为：

9、取300-500μl的重组枯草芽孢杆菌接种于25ml液体种子培养基中，25-35℃下活化2 至3代，待枯草芽孢杆菌达到1.0×108cfu/ml以上活菌数时，8000～10000rpm下离心10～20 min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15～20g/100ml 的脱脂乳)，待细胞浓度不低于107cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到微生物制剂。

10、本发明的第三个目的是提供在细胞内高效、稳定表达7α-羟基类固醇脱氢酶或7β-羟基类固醇脱氢酶的方法，所述方法是利用培养所述重组枯草芽孢杆菌生产7α-羟基类固醇脱氢酶或 7β-羟基类固醇脱氢酶。

11、在一种实施方式中，在摇瓶或发酵罐中，通过恒温培养或变温培养的方法来生产7α-羟基类固醇脱氢酶或7β-羟基类固醇脱氢酶。

12、在一种实施方式中，所述恒温培养方法为将所述重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵体系中，在36±2℃发酵至发酵液od600不低于15，然后向发酵液中添加终浓度为0.5～2mm 的iptg进行诱导，总发酵时间为20～30h。

13、在一种实施方式中，所述变温培养方法为将所述重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵体系中，在36±2℃发酵至发酵液od600不低于15，然后向发酵液中添加终浓度为0.5～2mm 的iptg、在40±2℃进行诱导，总发酵时间为20～30h；

14、或者在添加了终浓度为0.5～2mm的iptg后，在40±2℃和36±2℃下交替进行诱导，总发酵时间为20～30h。

15、优选地，所述交替进行诱导为在40±2℃下培养15～30min再在36±2℃下培养15～30min 这样交替培养，或是在36±2℃下培养15～30min再在40±2℃下培养15～30min这样交替培养。

16、在一种实施方式中，发酵结束后收集菌体，细胞破碎后去除细胞膜即得到含有7α-羟基类固醇脱氢酶或7β-羟基类固醇脱氢酶的原生质体。

17、本发明的第四个目的是提供一种合成人工熊胆粉的方法，所述方法是将上述方法培养得到菌体或原生质体转化合成人工熊胆粉。

18、在一种实施方式中，将鸡胆粉、表达了7α-羟基类固醇脱氢酶的菌体、7β-羟基类固醇脱氢酶的菌体，在含有nadp+的体系中，在25～35℃下反应不少于5h。

19、在一种实施方式中，将鸡胆粉、表达了7α-羟基类固醇脱氢酶的菌体或原生质体、7β-羟基类固醇脱氢酶的菌体或原生质体按照质量比5:1:3的量添加至反应体系中。

20、在一种实施方式中，nadp+浓度为1mm。

21、在一种实施方式中，反应结束后将反应液经乙醇溶解、沉淀、并收集上清液，将上清液浓缩干燥之后得到人工熊胆粉。

22、本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在利用鸡胆粉转化合成人工熊胆粉中的应用。

23、本发明的有益效果：

24、1.和现有技术中，在酵母中表达7α-hsdh和7β-hsdh酶相比，缩短了生产周期和成本。

25、2.枯草芽孢杆菌作为fda认证的“generally regarded as safe”(gras)食品级安全菌株，不含有细菌内毒素，具有安全性高，发酵周期短，生产成本低等特点，与在大肠杆菌中表达 7α-hsdh和7β-hsdh酶相比，规避了食品安全风险，可以全细胞投料的方式进行人工熊胆粉的转化生产。

26、3.本发明通过在质粒表达载体上融合部分枯草芽孢杆菌热激蛋白hsp的dna并配以热胁迫培养的方式增加了目的蛋白7α-hsdh和7β-hsdh酶的胞内表达量和菌体密度，解决了枯草芽孢杆菌胞内表达蛋白量少的问题。

27、4.本发明所提供的枯草芽孢杆菌可以实现天然熊胆粉主要成分(tudca)在胞外的积累，通过后期对转化体系的进一步优化和调整，可实现人工熊胆粉中tudca/tcdca的比例达到≥1的水平，人工熊胆粉中tudca与tcdca之和的百分含量达到≥55％的水平。