解淀粉乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及解淀粉乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤是人体内最大的器官，总重量大约占个体体重的16%，一方面维持机体稳定，另一方面也是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线。有研究表明，如果外界环境导致皮肤屏障中的相关基因异常，就会诱发皮肤疾病。
3.皮肤屏障是由角质层的表皮形成细胞和角质间的脂质形成的结构性的屏障。皮肤屏障防止人体过多水分释放，并防止如化学物质或微生物的有害物质进入我们的身体。组成死亡的角质细胞的表面的角质细胞外皮在细胞间脂质的稳定性中起重要作用。皮肤屏障受损将引起皮肤干燥, 皮肤老化、色素沉着异位性皮炎、湿疹、银屑病、鱼鳞病、日光性皮炎等皮肤敏感、刺激性皮炎、激素依赖性皮炎等皮肤油腻, 皮脂溢出性疾病, 如痤疮、酒糟鼻、脂溢性皮炎。
4.角质间结构性脂质神经酰胺，在基底层向角质分化过程中含量逐渐增加，到达角质层排至细胞间隙，构成防止水分丢失的屏障。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。角质层本身的亲水、屏障功能，以及角质层中所含有的天然保湿因子即氨基酸类，乳酸盐及糖类等作用，使得角质层通常含有10~30%的水分，这种环境成为了皮肤自身微生物菌落生长的摇篮。但随着年龄的增长，角质层的含水量会逐渐减少，当水分含量低于10%的时候，就会引起皮肤的各种问题。
5.皮肤衰老，包括由空气污染、吸烟、营养不良和紫外线（uv）等环境因素引起的外在衰老和由时间变化引起的内在衰老。其典型特征是皮肤变薄、产生细纹，这可能是由于细胞增殖减少以及随着年龄增长引起的真皮成分发生显着变化导致的。细胞外基质成分（胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等）随着皮肤衰老而显着减少。此外，伴随增龄，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，同时，与年龄相关的细胞修复能力下降，使得氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。
6.益生菌用在化妆品上，可显著抑制皮肤病原菌增殖，平衡皮肤表皮菌群，修复皮肤屏障。同时上调保湿、抗衰老、抗炎基因的表达，有效增加肌肤对营养物质的吸收，增强肌肤的免疫力。
7.敏感肌通常是由于皮肤细胞受损而使皮肤免疫力下降，角质层变薄导致皮肤滋润度不够，最终导致肌肤的屏障功能过于薄弱，无法抵御外界刺激，从而易于产生泛红，发热，瘙痒、刺痛等不适现象的产生。而皮肤屏障的受损，则会进一步导致金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的定植增殖，导致发炎红肿。皮肤常驻的表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis）与金黄色葡萄球菌相互拮抗，能够降低后者的增殖。因此降低金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌的菌群比例，有助于建立皮肤菌群的平衡分布，从而改善敏感肌。益生菌作为一种微生态制剂可用于平衡皮肤菌群，修复皮肤屏障，同时改善肌肤
状态，因此，提供一种利用微生态技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供解淀粉乳杆菌及其应用。
9.本发明提供了一种解淀粉乳杆菌（lactobacillus amylovorus ），其保藏编号为cctcc no:m 2022368。
10.本发明所述的解淀粉乳杆菌分离自酸菜浆水中，经16s rdna基因序列分析及ncbi数据库比对，鉴定其为解淀粉乳杆菌（lactobacillus amylovorus ）。
11.本发明提供了菌群，其包括本发明所述的解淀粉乳杆菌。
12.进一步的，本发明所述的菌群包括与所述的解淀粉乳杆菌不存在相互拮抗或竞争关系的单个或多个菌形成的菌群，本发明对此不做限定。
13.本发明提供了菌剂，其原料包括本发明所述的解淀粉乳杆菌， 和/或本发明所述的菌群。
14.进一步的，本发明所述的菌剂的制剂类型可以为粉剂、颗粒剂或液体制剂，本发明对此不做限定。
15.更进一步的，本发明所述的菌剂还包括所述菌株的发酵液，菌体，上清及其中所含活性物质，本发明对此不做限定。
16.本发明提供了如下i）~iii）任一项所示在制备改善肌肤状态产品中的应用；i）、本发明所述的解淀粉乳杆菌或其裂解物、提取物、代谢产物；ii）、本发明所述的菌群；iii）、本发明所述的菌剂。
17.本发明中，所述的改善肌肤状态包括修复皮肤屏障、保湿、抗衰老、促细胞增殖、抗炎、抑制皮肤病原菌或调节皮肤微生物菌群比例中的至少一种。
18.在本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有修复皮肤屏障的作用。所述的修复皮肤屏障包括修复化学损伤、修复氧化损伤或修复光射损伤，和/或上调屏障修护相关基因中的至少一种。
19.本发明中，所述的化学损伤包括任何可对人体造成轻度、中度或重度表皮细胞损伤的化学物质，本发明对此不做限定。更进一步的，本发明以hacat细胞受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对sds（十二烷基磺酸钠）引起的hacat细胞化学损伤的修复作用，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可缓解sds引起的化学损伤，提高细胞存活率，细胞存活率为109.57%~124.19%；说明所述解淀粉乳杆菌具有促进表皮细胞修复的作用。
20.本发明中，所述的氧化损伤包括过氧化物或活性氧损伤，本发明对此不做限定。所述的修复氧化损伤包括但不限于提高抗氧化相关基因的表达。所述的抗氧化相关基因包括pten、sirt-1。本发明以hff细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对h2o2引起的hff细胞氧化损伤的修复作用，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可上调h2o2引起的hff细胞抗氧化相关基因pten、sirt-1的表达，从而起到抗氧化作用，达到增强细胞氧化损伤修复能力的目的。
21.进一步的，本发明所述的修复皮肤屏障包括但不限于上调皮肤屏障修护相关基因的表达。本发明以hacat细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对hacat细胞皮肤屏障
修护相关基因的表达的影响，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可提高hacat细胞皮肤屏障修护相关基因flg、ivl、ovo1和lor中的表达，说明所述的解淀粉乳杆菌具有促进表皮细胞修复的作用。
22.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有皮肤保湿的作用。所述的保湿包括但不限于上调保湿相关基因。
23.进一步的，所述的保湿相关基因包括但不限于aqp3、gba。本发明以hacat细胞为受试对象，以水通道蛋白3基因aqp3和葡萄糖脑苷脂酶基因gba的表达为表征，测定所述的解淀粉乳杆菌对hacat细胞aqp3和gba表达的影响，结果表明，所述的淀粉乳杆菌具有上调aqp3和gba表达的作用，基因相对表达倍数为1.22~6.85，说明所述的解淀粉乳杆菌可促进皮肤保湿。
24.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有抗细胞衰老的作用。所述的抗衰老包括上调光老化细胞外基质合成相关基因、下调光老化细胞外基质降解相关基因、减少细胞凋亡、增加细胞免疫调节因子、增加细胞β-内啡肽生成或降低细胞蛋白羰基含量中的至少一种。
25.本发明中，所述的细胞外基质合成相关基因和细胞外基质降解相关基因均属于细胞外基质相关基因。进一步的，所述的细胞外基质合成相关基因包括ln、mkx、col1a1、col13a1、timp1和smad3；所述的细胞外基质降解相关基因包括mmp家族的mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8。本发明以hacat细胞和hff细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对hacat细胞和hff细胞外基质相关基因表达的影响，试验表明，所述的解淀粉乳杆菌可上调细胞外基质合成基因，下调细胞外基质降解基因，起到抗细胞衰老的作用。
26.本发明中，所述的减少细胞凋亡包括减少光老化引起的细胞凋亡、刺激物引起的细胞凋亡或损伤引起的细胞凋亡，本发明对此不做限定。进一步的，本发明所述的细胞凋亡相关基因包括但不限于bcl-2、caspase-3、caspase-9、bax，其中bcl-2为抗凋亡相关基因，caspase-3、caspase-9 、bax为细胞凋亡相关基因。更近一步的，本发明以hacat细胞和hff细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对细胞凋亡的影响，结果表明：所述的解淀粉乳杆菌可下调细胞凋亡相关基因的表达，抑制细胞凋亡，从而起到抗衰老作用。
27.本发明中，所述的细胞免疫调节因子相关基因包括但不限于mor，本发明对此不做限定。进一步的，本发明以hff细胞为受试对象，以mor基因表达为表征，研究所述的解淀粉乳杆菌对细胞免疫调节因子的影响，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可上调免疫调节因子相关基因，从而起到抗衰老作用。
28.本发明中，细胞分泌β-内啡肽，可达到抗衰老和延缓性衰老的作用。进一步的，本发明以hff细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对hff细胞β-内啡肽分泌的影响，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可提高细胞β-内啡肽分泌量，起到抗细胞衰老或延缓衰老的作用。
29.本发明中，细胞蛋白羰基的含量是细胞衰老的重要指标。进一步的，本发明以hff细胞为受试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对hff细胞蛋白羰基含量的影响，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可降低hff细胞蛋白羰基含量，从而起到抗细胞衰老的目的。
30.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有促进细胞增殖的作用。进一步的，所述的细胞增殖包括细胞分裂、发育、繁殖等生物学意义上符合细胞增殖的定义的范畴的生理现象，本发明对此不做限定。更进一步的，在一些具体的实施例中，本发明以人成纤维细胞hff为受
试对象，研究所述的解淀粉乳杆菌对hff细胞增殖的影响，结果表明解淀粉乳杆菌可促进hff增殖，促增殖率为26.36%~45.74%。
31.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有抗炎的作用。所述的抗炎包括降低细胞no生成量或下调炎症因子相关基因il-8、trpv1、il-6和il-22中的至少一种。
32.本发明中，细胞一氧化氮(no)具有促进炎症和抗炎的双重特性，正常情况下内皮源性no具有抑制炎症反应的作用，病理情况下诱导型no合成酶合成大量的no则有细胞毒作用，加重炎症反应；炎症因子相关基因的表达也与细胞抗炎联系密切，所述的炎症因子相关基因包括但不限于il-8、trpv1、il-6或il-22。进一步的，本发明以细胞raw264.7细胞为受试对象，探究所述的解淀粉乳杆菌对raw264.7细胞的no生成量及炎症因子相关基因表达的影响，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可以降低raw264.7细胞的no生成量，下调炎症因子相关基因的表达，起到抗炎的效果。
33.本发明中，所述的抗炎包括但不限于抵抗色素沉着异位性皮炎、日光性皮炎等皮肤敏感、刺激性皮炎、激素依赖性皮炎，本发明对此不做限定。
34.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有抑制皮肤病原菌的作用。人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、干瘪棒杆菌，为皮肤主要的致病菌，它们的定值在一定程度下会破坏皮肤角质，增加皮肤的敏感性。本发明以人葡萄球菌（staphylococcus hominis cgmcc 1.493）、溶血葡萄球菌（staphylococcus haemolyticus cgmcc 1.540）、干瘪棒杆菌（corynebacterium xerosis cgmcc 1.1919 ）为受试对象，对所述的解淀粉乳杆菌抑制皮肤病原菌的能力进行研究，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可抑制以上所述皮肤病原菌的生长，达到保护皮肤的健康的目的。
35.本发明中，所述的解淀粉乳杆菌具有调节皮肤微生物菌群的作用。金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌为主要的皮肤定殖菌群，其比例影响着皮肤菌群的健康，降低金黄色葡萄球菌的比例由于与良好皮肤菌群的构建。本发明以金黄色葡萄球菌金黄亚种（staphylococcus aureus subsp.aureus cgmcc 1.8721）和表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis cgmcc 1.4260）为受试对象，探究所述的解淀粉乳杆菌对皮肤菌群的调节作用，结果表明，所述的解淀粉乳杆菌可降低皮肤菌群中金黄色葡萄球菌的比例，达到维护健康皮肤菌群的目的。
36.本发明提供了改善肌肤状态产品，其包括如下i）~iii）任一项：i）、本发明所述的解淀粉乳杆菌或其裂解物、提取物、代谢产物；ii）、本发明所述的菌群；iii）、本发明所述的菌剂。
37.进一步的，本发明所述的产品包括化妆品，所述的化妆品剂型包括：膏霜类、乳液类、水剂类、凝胶类、油剂类、粉剂类、散粉、颗粒等、泥类、气雾剂类、贴、膜类、冻干类中的至少一种。
38.本发明还提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷或注射，本发明对此不做限定。
39.本发明获得了以下有益效果：本发明提供了解淀粉乳杆菌（lactobacillus amylovorus ），其保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 cctcc no: m 2022368。实验表明，解淀粉乳杆菌seuneu-111
具有维持及修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、促细胞增殖、抗炎、抑制皮肤病原菌及改善敏感肌的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等领域。
40.生物保藏说明解淀粉乳杆菌seuneu-111（lactobacillus amylovorus seuneu-111），于2022年4月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 2022368。
具体实施方式
41.本发明提供了解淀粉乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
42.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1 seuneu-111的分离于酸菜浆水中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为seuneu-111。
43.革兰氏染色镜检：菌株seuneu-111为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
44.实施例2 seuneu-111的核酸鉴定1、16s rdna基因序列分析：挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f，1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃ 15s，57℃ 15s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min。
45.2、结果pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较（blastn）后得出seuneu-111菌株为解淀粉乳杆菌（lactobacillus amylovorus）。
46.实施例3 seuneu-111促进sds诱导的人永生化角质形成细胞hacat损伤修复实验1、seuneu-111上清液和灭活菌体制备：挑取解淀粉乳杆菌seuneu-111单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量pbs重悬，稀释调整od
600
=0.2，为灭活菌体。
47.2、促进hacat细胞修复实验接种hacat细胞（5
×
104cells/孔）至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/ml sds，每孔加入100μl，5%二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加5%（v/v）上清液，10%（v/v）灭活菌体（对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体）培养24h。向每孔加入10μl的
cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸光度a。结果如表1所示：seuneu-111上清液及灭活菌体均对hacat细胞sds损伤具有修复作用，seuneu-111上清液及灭活菌体添加到经十二烷基硫酸钠（sds）损伤的人永生化角质形成细胞hacat，与对照相比细胞存活率增高，细胞存活率为109.57%~124.19%。以上实验结果表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有促进表皮细胞修复的作用。
48.实施例4 seuneu-111促进hacat屏障修护相关基因表达实验1、seuneu-111上清液和灭活菌体制备：制备方法参照实施例3。
49.2、促进hacat屏障修复相关基因表达实验接种hacat细胞（2ml/孔，内含5
×
105细胞）至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入上清液5%（v/v），灭活菌体10%（v/v），培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测flg、ivl、ovol1和lor基因的表达。以不添加seuneu-111上清液/灭活菌体处理组为对照（基因相对表达倍数f=1），利用2-δδct
法计算各样品f值。
50.公式：f=2-δδct
，其中：
△
ct
实验
=ct
实验-ct
内参（实验）;
△
ct
对照
=ct
对照-ct
内参（对照）;
△△
ct=
△
ct
实验
‑△
ct
对照。
51.结果见表2和表3：结果见表2和表3：体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111上清液和灭活菌体具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因flg、外皮蛋白基因ivl、ovo样转录因子1基因
ovol1和兜甲蛋白基因lor表达的作用，基因相对表达倍数1.55~4.33。以上结果显示seuneu-111具有促进皮肤屏障修复的作用。
52.实施例5 seuneu-111上调hacat保湿相关基因表达实验1、seuneu-111上清液和灭活菌体制备：制备方法参照实施例3。
53.2、上调hacat保湿相关基因表达实验接种人永生化角质形成细胞hacat（2ml/孔，内含5
×
105细胞）至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入上清液5%（v/v），灭活菌体10%（v/v），培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测aqp3和gba基因的表达。以不添加seuneu-111上清液/灭活菌体处理组为对照（基因相对表达倍数f=1），利用2-δδct
法计算各样品f值。
54.结果见表4和表5：结果见表4和表5：体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111的上清液和灭活菌体具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因aqp3和葡萄糖脑苷脂酶基因gba表达的作用，基因相对表达倍数1.22~6.85。以上结果显示， seuneu-111具有促进皮肤保湿的作用。
55.实施例6 seuneu-111调节光老化hacat细胞外基质/炎症因子相关基因表达实验1、seuneu-111上清液及灭活菌体制备制备方法参照实施例３。
56.2、hacat细胞制备及紫外线损伤将hacat细胞消化后以0.5ml/孔（内含2
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
57.3、seuneu-111添加将上清液5%（v/v）、灭活菌体10%（v/v）分别加入刺激过的hacat细胞（对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
58.4、qpcr法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col1a1、timp1和smad3，以及降解细胞外基质相关基因mmp1，炎症因子相关基因tnf-α的表达。以对照组基因相对表达倍数f=1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
59.上清液上调细胞外基质相关基因col1a1和timp1；下调降解细胞外基质相关基因
mmp1，炎症因子相关基因tnf-α。结果见表6：灭活菌体上调细胞外基质基因col1a1、smad3和timp1；下调炎症因子相关基因tnf-α。结果见表7。
60.体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有上调hacat细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因timp1、i型胶原α1链基因col1a1和smad3基因表达的作用，基因相对表达倍数1.23~1.84；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp1，以及细胞炎症因子相关的肿瘤坏死因子α基因tnf-α，基因相对表达倍数0.36~0.82。以上结果表明seuneu-111具有促进hacat细胞外基质合成、减少细胞外基质降解和炎症因子的抗衰老作用。
61.实施例7 seuneu-111促进人成纤维细胞hff的增殖1、seuneu-111上清液及灭活菌体制备：制备方法参照实施例3。
62.2、hff细胞制备及seuneu-111添加将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔（每孔含1.5
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。将上清液和灭活菌体以10%（v/v）加入hff细胞（对照组以等体积pbs替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
63.3、hff细胞转接及染色计数将24孔板内的hff细胞计数后适当稀释，以2ml/孔（每孔含2.0
×
103细胞）转接6孔板，每组3平行，5%二氧化碳培养箱37℃培养7~10天。对孔内细胞用多聚甲醛固定后结晶紫染色计数。根据公式计算细胞增殖率。
64.计算公式及结果如表8所示：
体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有促进人成纤维细胞hff增殖的作用，增殖率26.36%~45.74%。表明seuneu-111具有促进hff细胞增殖的作用。
65.实施例8 seuneu-111调节氧化损伤hff细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/炎症因子相关基因表达实验1、seuneu-111上清液及灭活菌体制备：制备方法参照实施例３。
66.2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔（内含2
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
67.3、seuneu-111添加将上清液5%（v/v）、灭活菌体10%（v/v）分别加入刺激过的hff细胞（对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
68.4、qpcr法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/炎症因子相关基因相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因ln、mkx和col13a1，细胞凋亡相关基因bcl-2，抗氧化相关基因pten和sirt-1，免疫调节因子相关基因mor；以及降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因caspase家族和bax，炎症因子相关基因il-6的表达。以对照组基因相对表达倍数f=1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
69.上清液上调细胞外基质相关基因ln、mkx和col13a1，抑制细胞凋亡基因bcl-2，抗氧化相关基因pten和sirt-1，免疫调节因子相关基因mor；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因caspase家族和bax，炎症因子相关基因il-6，结果见表9：
灭活菌体上调抑制细胞外基质相关基因ln，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor；下调细胞凋亡相关基因caspase-3和bax。结果见表10：体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有上调hff细胞外基质相关的层粘连蛋白ln、莫霍克蛋白基因mkx和xiii型胶原α1链基因col13a1，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，抗氧化相关的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因pten、sirtuins蛋白家族基因sirt-1，以及抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2表达的作用，基因相对表达倍数1.08~3.62倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp，细胞凋亡相关的bcl2-associated x蛋白基因bax和半胱氨酸蛋白酶家族基因caspase，以及细胞炎症因子相关的白介素6基因il-6，基因相对表达倍数0.32~0.95。表明seuneu-111具有促进hff细胞外基质合成、减少细胞凋亡、增加抗氧化、增加细胞免疫调节因子、减少细胞外基质降解、减少炎症因子的抗衰老作用。
70.实施例9 seuneu-111提高hff细胞β-内啡肽生成量1、seuneu-111上清液及灭活菌体制备：挑取解淀粉乳杆菌seuneu-111单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量pbs重悬，稀释调整od
600
=1.0，为灭活菌体。
71.2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
将dmem培养的hff细胞消化后以2ml/孔（内含5
×
105细胞）接种至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
72.3、seuneu-111添加将上清液和灭活菌体以5%（v/v）加入刺激过的hff细胞（对照组以等体积pbs替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
73.4、测定β-内啡肽表达量收集细胞培养液，按照江莱生物人β-内啡肽（β-ep）酶联免疫吸附测定试剂盒所述方法建立标准曲线，计算样品中β-内啡肽生成量及提高率。
74.标准曲线公式及测定结果如表11：结果显示seuneu-111具有提高hff细胞β-内啡肽生成量的抗衰老作用。
75.实施例10 seuneu-111降低hff细胞蛋白羰基含量实验1、seuneu-111上清液制备：制备方法参照实施例3。
76.2、hff细胞制备及紫外线损伤将hff细胞消化后以0.5ml/孔（内含1.5
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
77.3、seuneu-111添加将上清液5%（v/v）加入刺激过的hff细胞（对照组分别以等体积pbs替代上清液）。每组3平行，37℃培养过夜。
78.4、测定细胞蛋白含量及蛋白羰基含量将上述细胞弃去培养基后，加入ripa裂解液，提取细胞蛋白，分别按照南京建成总蛋白测定（考马斯亮蓝法）试剂盒和蛋白质羰基含量测定试剂盒所述方法测定样品中的蛋白羰基含量，并计算降低率。结果如表12：结果显示seuneu-111具有降低hff细胞蛋白羰基含量的抗衰老作用。
79.实施例11 seuneu-111降低raw264.7细胞no生成量1、seuneu-111上清液及灭活菌体制备：制备方法参照实施例3。
80.2、raw264.7细胞制备将raw264.7细胞消化后以0.5ml/孔（内含2
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
81.3、seuneu-111添加及lps刺激将上清液5%（v/v）、灭活菌体10%（v/v）分不同组加入培养过夜的raw264.7细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清液，按照碧云天no检测试剂盒所述方法进行标准曲线绘制，计算样品中no的浓度及抑制率。
82.计算公式及结果如表13：结果显示seuneu-111具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，与lps对照组相比降低14.08%~31.88%。
83.实施例12 seuneu-111下调hacat细胞炎症因子相关基因的表达1、seuneu-111上清液制备：制备方法参照实施例3。
84.2、hacat细胞制备将hacat细胞消化后以0.5ml/孔（内含2
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
85.3、seuneu-111添加及lps刺激将上清液5%（v/v）加入培养过夜的hacat细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5%二氧化碳培养箱37℃培养20h。
86.4、qpcr法检测细胞炎症因子基因相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测il-8、il-22和trpv1基因的表达。以不添加seuneu-111上清液处理组为对照（基因相对表达倍数f=1），利用2-δδct法计算各样品f值。结果见表14：体外细胞实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有下调lps诱导的hacat细胞炎症相关因子il-8、il-22和trpv1基因表达的作用，基因相对表达倍数0.32~0.87。表明seuneu-111具有抗炎作用。
87.实施例13 seuneu-111抑制皮肤病原菌的作用1、seuneu-111上清液制备：挑取解淀粉乳杆菌seuneu-111单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以mrs液体培养基稀释调整od
600
=2.0，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，上清液经0.22μm滤膜过滤为上清液。
88.2、病原菌菌液制备：将3种病原菌：人葡萄球菌（staphylococcus hominis cgmcc 1.493）、溶血葡萄球菌（staphylococcus haemolyticus cgmcc 1.540）、干瘪棒杆菌（corynebacterium xerosis cgmcc 1.1919），分别挑取单菌落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
=0.2。
89.3、抑制病原菌实验将灭活上清液以添加量10%（v/v）加入病原菌菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，37℃培养3h，检测菌液浓度（od
600
）并计算病原菌抑制率。计算公式及结果如表15：体外实验表明，本发明的解淀粉乳杆菌seuneu-111具有抑制皮肤病原菌人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干瘪棒杆菌增殖的作用，抑制率31.58%~80.77%。
90.实施例14 seuneu-111改变菌群比例改善敏感肌的作用1、seuneu-111上清液制备：制备方法参照实施例12。
91.2、敏感肌相关菌群菌液制备：将金黄色葡萄球菌金黄亚种（staphylococcus aureus subsp.aureus cgmcc 1.8721）和表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis cgmcc 1.4260）分别挑取单菌落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
=0.2。
92.3、添加上清液影响敏感肌相关菌群生长实验将上清液以10%（v/v）添加量分别加入两种皮肤菌群菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，37℃培养16h，以两种菌液相对浓度（od
600
）比值评价对敏感肌相关菌群生长影响。计算公式及结果如表16：
结果显示seuneu-111对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌无抑制。表明seuneu-111能够改变菌群比例，从而有效改善敏感肌。
93.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。