一种好氧反硝化组合菌剂及其制备方法和应用

1.本发明属于废水处理技术领域，具体涉及一种好氧反硝化组合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.废水处理是指利用物理、化学和生物的方法对废水进行处理，使废水净化，减少污染，以至达到废水回收、复用，充分利用水资源。其主要包括生活污水、工业废水等。废水处理方法包括物理处理法(如重力分离法、离心分离法、筛滤截留法和活性炭吸附法)、化学处理法及生物处理法。生物处理法主要是通过微生物的代谢作用，使废水中呈溶液、胶体以及微细悬浮状态的有机污染物，转化为稳定、无害的物质的废水处理法，根据作用微生物的不同，生物处理法又可分为需氧生物处理和厌氧生物处理两种类型。
3.氮的去除效率是废水处理中最重要的问题之一。由于常规的生物脱氮涉及好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，两类菌群对溶氧和有机碳的需求不同，这两个过程始终在不同的反应器中或在一个具有不同时间顺序的反应器中分别运行，从而导致工艺操作复杂，运行能耗和成本高。好氧反硝化技术提供了一种克服以上常规反硝化技术缺点的方法，在好氧条件下将硝酸盐转化为氮气。好氧反硝化菌剂强化应用虽然在短期内就可以有效增加污水处理系统的脱氮效能(duan et al.,2015；chen et al.,2019)，然而仍存在强化菌群流失严重，无法长期稳定地维持在系统中(chen et al.,2015)。如在悬浮污泥的中试规模sbr中添加好氧反硝化菌株lad9、gad3和gad4进行生物强化，长期运行后无法检测到这些菌株，暗示功能菌流失(chen et al.,2015)。研究表明，生物膜显示出良好的微生物保留能力和生物质的高度维持优势(de et al.,2018)。因此，利用好氧反硝化细菌在生物膜系统中的强化应用，为解决上述问题提供了新的路径(yang et al.,2018)。采用好氧反硝化细菌-生物膜系统的前提是能够让降解污染物的菌群与促进生物膜形成菌群组合起来应用，目前仍然存在一定问题，例如促进生物膜形成的细菌可能无法耐受污水中高浓度的污染物，降解污染物的细菌因难以完全固定在生物膜中而流失。此外，促进生物膜形成的细菌和降解污染物细菌共存时，菌群的生长可能会受到相互抑制(li et al.,2008)。这些问题都可能会降低污水处理效率，达不到理想的去污效果。解决上述问题的理想方案之一是进一步通过筛选获得既能够促进生物膜形成又能高效去除高浓度污染物的菌株。
4.微生物聚集是生物膜发育和活性污泥絮凝的重要一步。微生物在同一物种中的粘附能力称为自聚集，不同种的微生物相互粘附的能力称为共聚集。自聚集和共聚集都是生物膜形成的重要基础(arzmi et al.,2015)。研究表明，具有大量细胞外聚合物形成能力的自聚集菌株通过桥接介导非聚集菌株之间的共聚集，促进多物种淡水生物膜的发展(simoes et al.,2008)。共聚集有助于将微生物物种整合到生物膜中，促进基因和代谢物的交换，并支持微生物在各种环境条件下的生存(katharios-lanwermeyer et al.,2014)。
5.目前，兼具自聚集好氧反硝化能力的菌株报道较少(wang et al.,2018；hong et al.,2019)，且未见对其共聚集能力的评价，未获得共聚集最优组合菌剂，进而没有对共聚
集菌剂强化应用的潜能开展评估。因此，开发共聚集能力更好的组合菌剂，并将其应用于废水处理中，对于废水处理具有重要的意义。


技术实现要素：

6.针对以上问题，本发明提供了一种好氧反硝化组合菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种门多萨假单胞菌ihb602(pseudomonas mendocina)、甲基杆菌dc-1(methylobacterium gregans)和施氏假单胞菌ihb618(pseudomonas stutzeri)，所述的菌可用于废水处理，显著提高废水中无机氮的去除效率，共聚集能力枪，且其制备方法及应用工艺简单，可显著降低能耗及成本，对于废水处理具有重要的意义。
7.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
8.一方面，本发明提供了一种门多萨假单胞菌ihb602(pseudomonas mendocina)，所述的门多萨假单胞菌ihb602于2022年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为cctcc no.m2022494。
9.另一方面，本发明提供了一种甲基杆菌dc-1(methylobacterium gregans)，所述的甲基杆菌dc-1于2022年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为cctcc no.m2022232。
10.又一方面，本发明提供了一种施氏假单胞菌ihb618(pseudomonas stutzeri)，所述的施氏假单胞菌ihb618于2022年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为cctcc no.m2022493。
11.又一方面，本发明提供了上述门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和/或施氏假单胞菌ihb618在制备废水处理好氧反硝化组合菌剂中的应用。
12.具体地，所述的门多萨假单胞菌ihb618、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb602的数量比为1:0.5-2:0.5-2，优选为1:1:1。
13.又一方面，本发明提供了一种好氧反硝化组合菌剂，所述的组合菌剂包括上述门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和/或施氏假单胞菌ihb618。
14.具体地，所述的门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb618的数量比为1:0.5-2:0.5-2，优选为1:1:1。
15.又一方面，本发明提供了一种好氧反硝化组合菌剂的制备方法，所述的方法包括以下步骤：
16.(1)将菌株置于dtm培养基中生长，定期取样，测定od
600
值，并根据时间和od
600
值的关系绘制生长曲线图，在对数后期生长阶段收获菌液，离心，去除上清液，得到浓缩菌株；
17.(2)将浓缩菌株重悬于共聚集缓冲液中洗涤，得到含有菌株的悬浮液a；
18.(3)调节悬浮液a的吸光度值至od
600
＝1，得到悬浮液b；
19.(4)按照步骤(1)-(3)的方法，分别制得门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb618的悬浮液；
20.(5)将等体积的门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb618的悬浮液混合，并记录od
600
值；使用聚集指数计算共聚集的百分比，获得最优共聚集组合菌剂；
21.所述共聚集指数的公式为：
[0022][0023]
其中，at为静置时间为t小时的od
600
数值；a0为静置时间为0时的od
600
数值。
[0024]
具体地，步骤(1)中，所述定期取样的时间间隔为6h。
[0025]
具体地，步骤(1)中，所述离心的具体过程为4000-10000g，10分钟；优选为在5000g下离心10分钟。
[0026]
具体地，步骤(2)中，所述共聚集缓冲液为cacl2、nacl、tris(三羟甲基氨基甲烷)和mgcl2的混合溶液。
[0027]
具体地，所述混合溶液中各物质的浓度分别为：1mm cacl2，150mm nacl，10mm tris，1mm mgcl2。
[0028]
具体地，步骤(2)中，所述共聚集缓冲液的ph值为7.0。
[0029]
具体地，步骤(2)中，所述洗涤的次数为3-5次。
[0030]
又一方面，本发明提供了上述门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1、施氏假单胞菌ihb618和/或好氧反硝化组合菌剂在废水处理中的应用。
[0031]
具体地，所述的应用发生于序批式生物膜反应器(sbbr)中。
[0032]
又一方面，本发明提供了一种废水处理的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0033]
(1)在生物膜反应器中添加上述门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1、施氏假单胞菌ihb618和/或好氧反硝化组合菌剂，测量并分析生物膜的厚度和含量；
[0034]
(2)通入废水，进行废水处理；
[0035]
(3)在反应器稳定运行时，检测高效共聚集脱氮菌剂的丰度。
[0036]
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
[0037]
(1)本发明所述的门多萨假单胞菌ihb602、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb618的强化应用可显著提高无机氮去除效率，并且共聚集能力强，其菌剂均能成功定植，且对高氮含量表现出较强的耐受性。
[0038]
(2)高效共聚集好氧反硝化菌剂的强化应用可促进生物膜的发育，缩短成膜时间，实现膜生物反应器的快速启动。
[0039]
(3)高效共聚集好氧反硝化菌剂的强化应用可耐受高氮废水，长期运行，仍然占有一定的丰度。
[0040]
(4)高效共聚集好氧反硝化菌剂的强化应用可促进成膜和脱氮能力菌群丰度的增加，实现反应器的稳定高效运行。
[0041]
(5)高效共聚集脱氮菌剂的强化可应用在高富氮废水的去除，如养殖废水、污水处理厂废水、工业废水等，通过添加高效共聚集脱氮菌剂，测试进出水无机氮浓度，同时可应用于生物膜反应器用于反应器的快速启动和稳定性，可显著降低能耗及成本，对于废水处理具有重要的意义。
[0042]
保藏说明
[0043]
菌种名称：门多萨假单胞菌
[0044]
培养物名称及注明的鉴别特征：pseudomonas mendocina ihb602
[0045]
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
na2moo4·
2h2o、0.01g nicl2·
6h2o、0.01g na2seo3·
5h2o和0.01g cucl2·
2h2o。
[0074]
实施例1.一种好氧反硝化组合菌剂
[0075]
一种高效共聚集好氧反硝化组合菌剂的应用，包括以下步骤：
[0076]
(1)分别取菌株门多萨假单胞菌ihb618、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb602，将菌株置于tm中生长，间隔6小时定期取样，测定od
600
值，并根据时间和od
600
值的关系绘制生长曲线图，在对数后期生长阶段收获菌液，离心，去除上清液，得到浓缩菌株；
[0077]
(2)将浓缩菌株重悬于共聚集缓冲液(1mm cacl2，150mm nacl，10mm tris，1mm mgcl2，ph 7.0)中洗涤，得到含有菌株的悬浮液a；
[0078]
(3)调节悬浮液a的吸光度值至od
600
＝1，得到悬浮液b；
[0079]
(4)按照步骤(1)-(3)的方法，分别制得门多萨假单胞菌ihb618、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb602的悬浮液；
[0080]
(5)将等体积的门多萨假单胞菌ihb618、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb02的悬浮液混合，并记录od
600
值；使用聚集指数计算共聚集的百分比，获得最优共聚集组合菌剂；
[0081]
所述共聚集指数的公式为：
[0082][0083]
其中，at为静置时间为3小时的od
600
数值；a0为静置时间为0时的od
600
数值；
[0084]
(6)使用两个平行的实验室规模的sbbr系统，菌剂强化系统sbbr
t
和普通系统sbbrc；sbbrc作为对照不添加菌剂。在sbbr
t
中，在生物膜形成发育期间将500ml等比例的纯培养物样菌株(od
600
值为1)添加到反应器中；开始运行，测量并分析生物膜的厚度和含量；同时通入成分为含50mg/l硝氮的硝酸钠和含50mg/l氨氮的氯化铵的合成废水；当生物膜成熟的标志物(生物膜量和生物膜厚度达到最大值的时间，本例为36天)达到了稳定值(自36天稳定运行至第40天)(如图3)；之后(第41天开始)，分别以150mg/l氨氮(第一阶段，运行第41-60天)，200mg/l氨氮(第二阶段，运行第61-80天)，300mg/l氨氮(第三阶段，运行第81-120天)逐渐增加合成废水中氯化铵的浓度，每个时期进水组分中均含有50mg/l硝氮(即通入的合成废水中硝氮的含量不变，仅改变氨氮的含量)，并使用乙酸钠作为碳源，确保每个时期的碳氮比(c/n)为15。
[0085]
(7)sbbr反应器长期稳定运行下(自开始运行至120天)，检测高效共聚集脱氮菌剂的丰度显示，菌株门多萨假单胞菌ihb618、甲基杆菌dc-1和施氏假单胞菌ihb602均能定植在系统膜上(0.19％，0.02％，0.11％)，见图7(sbbr长期运行120天，菌剂在属水平上定植情况，星号表示显著高于对照组)。
[0086]
实验例1
[0087]
1.菌株的共聚集测试
[0088]
测定静置3小时的od
600
值，按照聚集指数公式，计算得出对应单菌株及组合菌株的聚集指数，结果见图2。
[0089]
由图2数据可知，本发明所述菌株的共聚集(聚集指数为50％)优于其他组合(最大聚集指数为46％)。
[0090]
2.生物膜厚度和重量
[0091]
具体方法：带膜载体球105℃过夜烘干后减去空白球为所测重量为生物膜量，微电极测试平台测定生物膜厚度，由图3可知，生物膜形成期强化组载体球上的平均生物膜重量和厚度高于对照组。
[0092]
3.氨氮浓度测试
[0093]
具体方法：分光光度法测定氨氮进出水浓度，氮素去除率为：(进水氮素浓度-出水氮素浓度)/进水氮素浓度；由图4可知，生物膜稳定期，随着氮载荷的增加，不同氮载荷下强化组中氨氮浓度低于对照组，去除效率高于对照组。在长期运行的300mg/l的高浓度载荷下，强化组的氨氮去除率为95.19％，高于对照组(93.90％)。
[0094]
4.硝氮浓度测试
[0095]
具体方法：使用离子色谱测定硝氮进出水浓度，氮素去除率为：(进水氮素浓度-出水氮素浓度)/进水氮素浓度；由图5可知，生物膜稳定期，随着氮载荷的增加，不同氮载荷下强化组中硝氮浓度均低于对照组，去除效率均高于对照组。强化组的硝氮去除率为86.1％显著高于对照组的去除率(80.69％)。
[0096]
5.亚硝氮的积累量测试
[0097]
具体方法：离子色谱测定亚硝氮出水浓度。如图6可知，生物膜稳定期，随着氮载荷的增加，不同氮载荷下强化组中亚硝氮浓度(4.78mg/l)低于对照组(7.79mg/l)。废水中的氨氮和硝氮在运行过程中会转化成亚硝氮，导致亚硝氮在废水中积累，强化组中较少的亚硝氮积累说明了更好的无机氮去除性能。由以上可知，本发明提供的组合菌剂具有较好的无机氮去除效果。
[0098]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。