一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法

本发明涉及一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程。

背景技术：

1、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，ec.3.2.l.20)，又名α-d-葡萄糖苷水解酶或α-葡萄糖基转移酶，广泛存在于许多植物、动物、微生物中。根据其底物特异性和蛋白质一级结构，将该酶分成α-葡萄糖苷酶ⅰ、ⅱ两个家族，也就是糖苷水解酶(gh)家族13和31，还可将该酶分成α-葡萄糖苷酶ⅰ、ⅱ、ⅲ，这三种类型。例如，α－葡萄糖苷酶家族ⅰ中的成员，能够水解不同质底物如对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷和蔗糖，且属于α-葡萄糖苷酶ⅰ型，而α-葡萄糖苷酶家族ⅱ中的成员则较易水解同质底物如可溶性淀粉、糖原和麦芽低聚糖等，且属于α-葡萄糖苷酶ⅲ型。大多数α-葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖并发生转苷作用。例如，黑曲霉α-葡萄糖苷酶能从麦芽糖等分子中的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，并能将游离出的葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖等分子中的α-1，6位，形成异麦芽糖、潘糖等低聚异麦芽糖。低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，imos)能使人体内的双歧杆菌得到显著增殖，促进食物的消化吸收，调整肠道内的菌群，增加有益菌的比例，维持肠道正常功能等。将具有潜在价值的α-葡萄糖苷酶基因转入到其它适于工业化生产的工程菌中，实现低成本、高效率表达，用于转苷生产低聚异麦芽糖，具有重要的理论和应用价值。

2、目前，工业上应用的α-葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α-葡萄糖苷酶在规模化生产imos上的应用。

技术实现思路

1、为了解决目前α-葡萄糖苷酶热稳定性不高的问题，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶的环化突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的α-葡萄糖苷酶的n端和c端分别连上不同的异肽键得到的；所述异肽键包括(a)～(c)任一组：

2、(a)n端：ahivmvdaykptk(seq id no.3所示)；c端：vdtlsglsseqgqsgdmtieedsathikfskrdedgkelagatmelrdssgktistwisdgq vkdfylypgkytfvetaapdgyevataitftvneqgqvtvngkatkgdahi(seq id no.4所示)；

3、(b)n端：klgdiefikvnk(seq id no.5所示)；c端：

4、kplrgavfslqkqhpdypdiygaidqngtyqnvrtgedgkltfknlsdgkyrlfensepa gykpvqnkpivafqivngevrdvtsivpqdipatyeftngkhyitnepippk(seq id no.6所示)；

5、(c)n端：dpivmidndkpit(seq id no.7所示)；c端：

6、lsgetgqsgnttieedstthvkfskrdangkelagamielrnlsgqtiqswisdgtvkvfyl mpgtyqfvetaapegyelaapitftidekgqiwvds(seq id no.8所示)。

7、在一种实施方式中，编码所述α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的α-葡萄糖苷酶的n端和c端分别连上seq id no.3所示的spytag和seq id no.4所示的spycatcher得到的，命名为:spytag-agl-spycatcher，编码该突变体的核苷酸序列如seq id no.9所示。

9、在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的α-葡萄糖苷酶的n端和c端分别连上seq id no.5所示的snooptag和seq id no.6所示的snoopcatcher得到的，命名为：snooptag-agl-snoopcatcher，其核苷酸序列如seq idno.10所示。

10、在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no.1所示的α-葡萄糖苷酶的n端和c端分别连上seq id no.7所示的sdytag和seq id no.8所示的sdycatcher得到的，命名为:sdytag-agl-sdycatcher，其核苷酸序列如seq id no.11所示。

11、本发明还提供了编码所述突变体的基因。

12、在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.9～11所示。

13、本发明还提供了携带所述基因的质粒。

14、在一种实施方式中，所述质粒为pma5。

15、本发明还提供了表达所述α-葡萄糖苷酶的突变体的重组微生物。

16、在一种实施方式中，所述重组微生物以枯草芽孢杆菌(bacillus.subtilis)为表达宿主。

17、在一种实施方式中，所述重组微生物以枯草芽孢杆菌168为表达宿主。

18、在一种实施方式中，所述重组微生物以pma5为表达载体。

19、本发明提供了一种提高α-葡萄糖苷酶热稳定性的方法，所述方法为，将核苷酸序列如seq id no.1所示α-葡萄糖苷酶的n端和c端分别连上不同的异肽键得到的。

20、本发明还提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法具体步骤如下：

21、(1)以seq id no.2所示核苷酸序列为模板，根据两端不同的异肽键标签设计引物，进行pcr扩增获得含有异肽键标签的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体；

22、(2)将步骤(1)制备的含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内；

23、(3)培养步骤(2)构建的重组微生物细胞，收集α-葡萄糖苷酶环化突变体。

24、本发明还提供了所述重组微生物在制备α-葡萄糖苷酶中的应用。

25、在一种实施方式中，所述应用是将所述重组微生物在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的α-葡萄糖苷酶。

26、本发明还提供了上述α-葡萄糖苷酶环化突变体，或编码上述突变体的基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在转化麦芽糖生产低聚异麦芽糖中的应用。

27、有益效果：

28、(1)本发明在天然α-葡萄糖苷酶的基础上，通过理性设计，结合基于异肽键的环化作用改造α-葡萄糖苷酶分子结构，分析了环化对酶热稳定性的影响，并最终获得了三株稳定性提高的突变菌株spytag-agl-spycatcher、snooptag-agl-snoopcatcher和sdytag-agl-sdycatcher，与天然α-葡萄糖苷酶(65℃孵育42h后剩余酶活为42.1％)相比，本发明提供的α-葡萄糖苷酶环化突变体spytag-agl-spycatcher在65℃孵育42h的剩余酶活为53.6％，是天然α-葡萄糖苷酶的1.25倍；α-葡萄糖苷酶环化突变体snooptag-agl-snoopcatcher的剩余酶活为73.29％，是天然α-葡萄糖苷酶的半衰期的1.74倍；突变体snooptag-agl-snoopcatcher的剩余酶活为54.16％，是天然α-葡萄糖苷酶的半衰期的1.28倍。

29、(2)本发明提供的α-葡萄糖苷酶环化突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。

30、(3)本发明所得的α-葡萄糖苷酶环化突变体比野生型更适合于催化麦芽糖转化生产低聚异麦芽糖的应用，最适温度和热稳定性的提高有利于反应在更高的温度下进行，反应温度的提高有利于降低反应液的黏度、提高催化反应速率和低聚异麦芽糖的转化率，更利于生产工艺的灵活性。