JAK1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用

本发明属于分子病毒学和细胞生物学，公开了一种jak1蛋白的 k859/k860位点在在制备干扰素耐受细胞中的应用。

背景技术：

1、jak/stat信号通路是介导包括干扰素(interferon，ifn)在内的多种细胞因子下游信号转导的重要通路，对于细胞因子功能的发挥具有重要作用。其中酪氨酸激酶jak(januskinase)家族包含四种蛋白，分别为jak1，jak2，jak3和tyk2。不同细胞因子功能的发挥依赖于不同组合的jak/stat信号通路，最终介导细胞因子下游效应基因的转录，进而发挥相应的免疫调控作用，对于宿主机体免疫反应的发挥至关重要。泛素化修饰在蛋白降解过程中发挥重要作用，研究显示jak1的降解依赖于泛素连接酶和泛素化修饰过程，例如泛素连接酶rnf125可以介导jak1的泛素化降解，jak1的泛素化降解可以抑制 ifns和白细胞介素下游信号通路的转导，进而对宿主细胞的免疫反应发生调节作用。病原微生物可以通过促进jak1降解而拮抗其介导的宿主免疫反应。研究显示，如人巨细胞病毒(hcmv)、人偏肺病毒(hmpv)和寨卡(zika) 病毒可以通过促进jak1的蛋白酶体途径降解，抑制ifn抗病毒效应。流感病毒(iav)的蛋白降解jak1的具体机制以及降解jak1关键的氨基酸位点还不清楚。通过iav pb2蛋白降解jak1，探究jak1的关键功能性位点，对有效地开发制备干扰素耐受细胞具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明发现jak1蛋白第859和860位的k突变为r，降低了jak1介导的isgs的产生，从而抑制了其介导的抗病毒活性。研究表明流感病毒(iav) pb2蛋白通过与jak1相互作用并以泛素-蛋白酶体依赖方式降解jak1。进一步证明jak1的k859/k860位点是iav pb2蛋白降解的关键氨基酸位点。因此，可以通过探究病毒蛋白降解jak1的位点，筛选jak1介导isgs的功能性位点。

2、本发明具体采用以下技术方案：

3、jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，所述jak1蛋白泛素化位点位于jak1蛋白第859和860位，jak1氨基酸序列如seq id no：1 所示。

4、进一步的，jak1核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、进一步的，所述jak1蛋白来源为哺乳动物。

6、进一步的，所述jak1蛋白第859和860位的k突变为r后，消除jak1 的泛素化位点，解除jak1所受到的泛素化调控。

7、进一步的，位点突变采用的引物序列如seq id no：3和seq id no：4 所示。

8、进一步的，所述的细胞为hek293t，mdck，a549细胞。

9、进一步的，构建用于慢病毒包装的shrna质粒，将shrna或shjak1和 jak1质粒的转染hek293t细胞，进行慢病毒包装，将质粒进行转染，收集包含病毒的培养液。

10、进一步的，所述jak1基因的shrna靶点序列如下：

11、shjak-1#序列为seq id no：5；

12、shjak-2#序列为seq id no：6。

13、进一步的，包装好的shjak1慢病毒感染hek293t，48h后，加入 puromycin筛选，待细胞没有明显的死亡现象后再进行有限稀释法亚克隆；3代后的细胞用作稳定表达的细胞系。

14、本发明还提供jak1蛋白泛素化位点的引物，所述jak1蛋白泛素化位点位于jak1蛋白第859和860位，所述的引物序列如seq id no：7和seq id no：8所示。

15、第一方面，jak1的859r/860r位点在介导抗病毒活性的作用。

16、具体操作过程如下：

17、(1)敲低jak1的细胞系的构建。

18、(2)jak1及其定点突变体对ifn诱导的isgs产生的影响。

19、(3)检测jak1及其定点突变体对iav复制的影响。

20、第二方面，iav pb2蛋白结合jak1并通过泛素-蛋白酶体途径降解jak1。

21、具体鉴定过程如下：

22、(1)通过co-ip和共聚焦实验证明pb2和jak1发生相互作用。

23、(2)pb2基因重组载体转染细胞，或病毒感染细胞，检测jak1蛋白的表达水平。

24、(3)通过特定靶点敲低pb2的表达，构建pb2敲低细胞系。

25、(4)在shpb2细胞系中进行回补pb2质粒，鉴定jak1的表达水平。

26、(5)在shpb2细胞系中进行感染iav，鉴定jak1的表达水平。

27、(6)pb2转染细胞，转染后加入蛋白酶体抑制剂mg132进行处理，鉴定 jak1的表达水平。

28、(7)通过泛素化实验证明pb2促进jak1的k48连接的泛素化修饰。

29、第三方面，jak1的k859/k860位点是iav pb2蛋白降解的关键氨基酸位点。

30、具体操作过程如下：

31、(1)根据jak1的功能结构域，构建其缺失突变体。

32、(2)pb2真核表达质粒和jak1缺失突变体共转染细胞后，检测jak1及其缺失突变体的表达水平。

33、(3)通过在线软件预测jak1泛素化位点，定点突变jak1位点。

34、(4)jak1的定点突变体和jak1共转细胞后，检测jak1及其定点突变体的表达水平。

35、(5)通过泛素化实验证明pb2泛素化jak1的关键氨基酸位点。

36、有益效果

37、本发明发现iav介导的jak1的k859和860泛素化位点，又是其介导 isgs的功能性位点。

38、本发明有助于拓宽在探究病毒蛋白降解jak1的位点，筛选jak1介导 isgs的功能性位点的新思路，同时也有助于利用jak1功能位点作为开发制备干扰素耐受细胞的新靶点。

技术特征：

1.jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，所述jak1蛋白泛素化位点位于jak1蛋白第859和860位，jak1氨基酸序列如seq id no：1所示。

2.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，jak1核苷酸序列如seq id no：2所示。

3.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，所述jak1蛋白来源为哺乳动物。

4.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，所述jak1蛋白第859和860位的k突变为r后，消除jak1的泛素化位点，解除jak1所受到的泛素化调控。

5.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，位点突变采用的引物序列如seq id no：3和seq id no：4所示。

6.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，所述的细胞为hek293t，mdck，a549细胞。

7.如权利要求1所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，构建用于慢病毒包装的shrna质粒，将shrna或shjak1和jak1质粒的转染hek293t细胞，进行慢病毒包装，将质粒进行转染，收集包含病毒的培养液。

8.如权利要求7所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，所述jak1基因的shrna靶点序列如下：

9.如权利要求7所述的jak1蛋白泛素化位点在制备干扰素耐受细胞中的应用，其特征在于，包装好的shjak1慢病毒感染hek293t，48h后，加入puromycin筛选，待细胞没有明显的死亡现象后再进行有限稀释法亚克隆；3代后的细胞用作稳定表达的细胞系。

10.jak1蛋白泛素化位点的引物，其特征在于，所述jak1蛋白泛素化位点位于jak1蛋白第859和860位，所述的引物序列如seq id no：7和seq id no：8所示。

技术总结
本发明属于分子病毒学和细胞生物学技术领域，公开了一种酪氨酸激酶蛋白JAK1泛素化位点赖氨酸lysine(K)859和860在制备干扰素耐受细胞中的应用。本发明发现流感病毒(IAV)PB2蛋白与JAK1蛋白发生相互作用，并通过泛素‑蛋白酶体途径降解JAK1。最终明确JAK1蛋白的K859和860是其泛素化位点。本发明将JAK1蛋白第859和860位的K突变为精氨酸arginine(R)，解除JAK1所受到流感病毒PB2介导的泛素化降解，同时也降低了JAK1介导的ISGs的产生从而抑制了其介导的抗病毒活性。该位点有望成为开发制备干扰素耐受细胞的新靶点。

技术研发人员：陈素娟,杨辉,彭大新,秦涛
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12