支链氨基酸生物合成所用酶的突变体及其构建方法与应用与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及支链氨基酸生物合成所用酶的突变体及其构建方法与应用。

背景技术：

1、支链氨基酸(branch chain amino acid，bcaa)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，l-缬氨酸(l-valine)，化学名称为l-α-氨基异戊酸，分子式为c5h11no2，相对分子质量为117.15。l-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/l，50℃的溶解度为96.2g/l，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。

2、l-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。l-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，l-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，l-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。l-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，l-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。

3、目前，l-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产l-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产l-缬氨酸最主要的方法。但目前l-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种利用微生物生产支链氨基酸l-缬氨酸的方法，以及能够高效率生产支链氨基酸l-缬氨酸的新微生物。具体地，本发明的目的是提供一种高产l-缬氨酸且副产物亮氨酸及异亮氨酸产量低的l-缬氨酸菌种。

2、第一方面，本发明提供一种支链氨基酸生物合成所用酶的突变体，所述突变体包括：ilvn基因编码的野生型乙酰羟酸合酶的第25位氨基酸由缬氨酸v突变为异亮氨酸i，形成乙酰羟酸合酶突变体；

3、和/或，ilvc基因编码的野生型乙酰羟酸异构还原酶的第90位氨基酸由异亮氨酸i突变为丝氨酸s，形成乙酰羟酸异构还原酶突变体。

4、ilvn基因(在ncbi上的参考序列编号为cey17_rs06890)编码的乙酰羟酸合酶(在ncbi上的参考序列编号为wp_003861429.1)是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。

5、ilvc基因(在ncbi上的参考序列编号为cey17_rs06895)编码的乙酰羟酸异构还原酶(在ncbi上的参考序列编号为wp_003854117.1)是支链氨基酸生物合成过程中的一种重要酶，它催化1分子的α-乙酰乳酸或α-乙酰羟丁酸生成1分子的α-二羟基异戊酸或α,β-二羟甲基戊酸(α-二羟基异戊酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物，α,β-二羟甲基戊酸是异亮氨酸的前体物)，同时消化1分子的还原力(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nadph)产生1分子的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)。

6、在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，野生型乙酰羟酸合酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述乙酰羟酸合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。

7、在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述乙酰羟酸合酶突变体编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述野生型乙酰羟酸异构还原酶的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述乙酰羟酸异构还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.8所示。

9、在本发明所提供的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体中，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

10、第二方面，本发明提供一种生物材料，含有上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体。

11、更进一步地，对本发明所述生物材料中的ppc和/或gnda基因进行修饰，强化ppc和/或gnda基因的表达。

12、ppc、gnda基因在ncbi上的参考序列编号分别为cey17_rs08480、cey17_rs07800。

13、具体地，本发明所提供的生物材料为微生物，所述微生物的原始菌株包括：谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；

14、优选地，所述原始菌株由保藏编号为cgmcc no.13406的菌株的a-异丙基苹果酸合酶基因leua编码区第1个碱基由a突变为g后得到的。

15、本发明的出发菌株mhz-1012-3为谷氨酸棒杆菌，其构建方法见专利文件cn201911370732.9，该菌为出发菌株mhz-1012-2的a-异丙基苹果酸合酶基因leua其编码区第1个碱基由a突变为g得到。mhz-1012-2于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.13406，见专利文件cn201611250330.1。

16、本发明通过对谷氨酸棒杆菌来源的ilvn基因和/或ilvc基因修饰，实现了对乙酰羟酸合酶和/或乙酰羟酸异构还原酶的突变，使得所述微生物产缬氨酸的能力与未修饰的菌株相比增强，产副产物异亮氨酸的能力下降，最终提高了缬氨酸的产量。

17、根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或上述的生物材料在生物合成支链氨基酸或其衍生物中的应用。

18、上述的支链氨基酸生物合成所用酶的突变体或上述的生物材料在增加l-缬氨酸产量同时降低l-缬氨酸生物合成过程中亮氨酸或异亮氨基酸产量中的应用。

19、本发明的有益效果在于：

20、本发明提供的乙酰羟酸合酶突变菌株mhz-1012-31的缬氨酸积累量达到9.9g/l，较出发菌株mhz-1012-3增长2.4g/l，提升幅度达到32％，且副产物异亮氨酸积累量为1.5g/l，较出发菌株mhz-1012-3下降34.8％，亮氨酸和菌体od无显著变化。

21、本发明提供的乙酰羟酸异构还原酶突变菌株mhz-1012-35的缬氨酸积累量达到10.5g/l，较出发菌株mhz-1012-3增长3.0g/l，提升幅度达到40％，且副产物异亮氨酸没有进一步增加，异亮氨酸的积累量为1.5g/l，较出发菌株mhz-1012-3下降34.8％，亮氨酸增加0.2g/l，增幅22.2％，菌体od无显著变化。

22、由此可见，本发明提供的乙酰羟酸合酶突变体ilvnv25i和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvci90s，及其突变菌株对主产物缬氨酸产量有显著的正效果，对副产物异亮氨酸产量有显著的负效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。

23、同时，在乙酰羟酸合酶突变体ilvnv25i和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvci90s的基础上，叠加ppc增强、或ppc和gnda同时增强，缬氨酸的积累量显著增加，分别达到12.1g/l和13.8g/l，提高幅度分别达到13.2％和31.4％。由此可见，乙酰羟酸合酶突变体ilvnv25i和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvci90s，与ppc增强、或ppc和gnda同时增强叠加，有显著正效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。