一种肺炎克雷伯氏菌及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种肺炎克雷伯氏菌及其应用。


背景技术：

2.磷作为植物生长必需的矿质元素，是作物高产优质生产中不可或缺的营养元素。土壤中大部分磷是以无效态的矿物磷存在于土壤中，并不能直接被作物吸引利用。溶磷菌可以通过微生物分泌的有机酸将土壤中矿物磷溶解出来供植物利用，能提高土壤有效磷的含量。在肥料中添加溶磷菌可显著提高土壤中磷肥利用率，但传统的溶磷肥是将分开发酵的溶磷菌和肥料物理混合到一起形成的，添加进去的溶磷菌一般存活期较短，实际应用效果不佳。
3.黑水虻(hermetia illucens l.)，是腐生性的水虻科昆虫，取食禽畜粪污和生活垃圾等易腐垃圾，转化为高价值的动物蛋白饲料，因其繁殖迅速，生物量大，食性广泛、吸收转化率高，容易管理、饲养成本低，动物适口性好等特点，在餐厨垃圾、禽畜粪便转化为昆虫蛋白的研究领域，黑水虻很快就从众多的双翅目昆虫中脱颖而出，受到了广泛的关注，在全世界范围内得到广泛推广。人们可以利用黑水虻可以将易腐垃圾快速转换为昆虫蛋白，另外，黑水虻虫粪(又称为虫沙)是优质的有机肥。
4.黑水虻在取食过程中不停蠕动可持续不断地供氧和散热，可为各类土壤益生菌的发酵提供天然的、优良发酵环境，与传统的液体发酵相比，固体发酵能同时、同地发酵多种有益微生物，另外，由于菌和肥是同时，在同一个体系中生产的，菌与肥之间存在一个协同共建的相互适应过程，这样，菌与肥天然共存，能显著提高有益菌的存活率和活性。利用黑水虻生产的功能菌肥与传统的菌肥相比，具有稳定性更好、货架期更长、活性更高等特点。可以利用黑水虻这一特性，作为生物反应器来生产生物菌肥，但现有的一些功能微生物大多数经黑水虻肠道后数量减少，并不能有效进行扩繁，这是因为黑水虻能分泌多种抗菌肽，这些抗菌肽能杀死大部分微生物。
5.而黑水虻肠道的有益微生物能很好适应黑水虻特殊的肠道环境。因此从黑水虻肠道分离出有益微生物，然后将使其在黑水虻幼虫中生存，从而可利用黑水虻幼虫生物反应器进行发酵生产生物有机肥。有鉴于此，从黑水虻肠道的有益微生物中分离鉴定出可高效溶磷的微生物成为一个需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的在于提供一种高效溶磷的肺炎克雷伯氏菌。
7.本发明的第二个目的在于提供所述高效溶磷的肺炎克雷伯氏菌的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
9.本发明提供的菌种为一种肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)，所述肺炎克雷伯氏菌的保藏号为cgmcc no.24232。
10.具体的，本发明提供的肺炎克雷伯氏菌,其分类命名为klebsiella pneumoniae，
该菌株已于2022年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位代码为cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmccno.24232。该菌在保藏时是存活的。
11.所述肺炎克雷伯氏菌的16s rdna序列如seq id no.1所示。
12.所述肺炎克雷伯氏菌的胞外存在磷酸酶和葡萄糖脱氢酶。
13.所述葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如seq id no.2所示；
14.所述磷酸酶的基因id为01054、02906、03142、03546、03928、04696、04896、05019和05236。
15.所述肺炎克雷伯氏菌可在胞外通过所述葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸；
16.所述肺炎克雷伯氏菌可在胞外通过所述磷酸酶将有机磷分解。
17.所述的肺炎克雷伯氏菌的应用，应用于分解难溶性磷源。
18.所述难溶性磷源包括磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、植酸钙或卵磷脂；或者
19.所述难溶性磷源为磷酸钙、磷酸铁或磷酸铝；或者
20.所述难溶性磷源为磷酸钙。
21.所述分解难溶性磷源的初始ph为6。
22.一种所述的肺炎克雷伯氏菌的应用，应用于促进植物的生长；所述植物包括小白菜。
23.一种包括所述的肺炎克雷伯氏菌的溶磷剂。
24.相比于现有技术，本发明带来以下技术效果：
25.本发明提供的肺炎克雷伯氏菌的胞外存在磷酸酶和葡萄糖脱氢酶，因此其可可高效溶解环境中的有机磷和无机磷。
26.本发明提供的肺炎克雷伯氏菌由于可高效溶磷，因此其可促进植物的生长。
27.本发明提供的肺炎克雷伯氏菌可利用黑水虻幼虫这一天然生物反应器发酵生产生物有机肥。由于菌与肥属于同位生产，相互之间充分协同互作，可做到菌、肥自然一体，可有效提高功能菌在有机肥中的存活率和延长其货架期。因此，包括所述肺炎克雷伯氏菌的溶磷剂具有高效溶磷且保持期长的特点。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
29.图1示出了溶磷菌在无机磷筛选平板上的初筛结果；
30.图2示出了菌株lxr-1经16s rrna的鉴定图；其中，图2(a)示出了菌株lxr-1的16s rrna与ncbi的16s rrna序列库blastn比对结果；图2(b)示出了基于nj法构建的16s rrna系统进化树基于nj法构建的16s rrna系统进化树；
31.图3示出了菌株lxr-1对不同磷源的分解能力对比图；
32.图4示出了初始ph值对菌株lxr-1的溶磷能力示意图；
33.图5示出了菌株lxr-1发酵液中磷酸酯酶在不同ph值条件下的活性示意图；
34.图6示出了葡萄糖脱氢酶跨膜结构域；
35.图7示出了葡萄糖酸脱氢酶亚细胞定位deeploc预测结果；
36.图8示出了不同菌株的葡萄糖脱氢酶序列比较与溶磷能力差异示意图adw中，图8(a)示出了不同菌株的葡萄糖脱氢酶系统进化树；图8(b)示出了不同菌株的葡萄糖脱氢酶多序列比对；图8(c)示出了菌株cg43与lxr-1溶磷圈比较；
37.图9示出了lxr-1的葡萄糖脱氢酶编码基因(kbgdh)转化的大肠杆菌获得的溶磷能力与原始大肠杆菌的溶磷能力对比图；
38.图10示出了了菌株lxr-1对小白菜的促生作用示意图，其中图10(a)示出了菌株lxr-1对小白菜株高的影响；图10(b)示出了菌株lxr-1对小白菜鲜重的影响；图10(c)示出了菌株lxr-1对小白菜叶片全磷含量的影响。
具体实施方式
39.现有的生物有机肥生产大都是菌与肥分开生产，然后将两者按一定的比例进行物理混合，由于菌与肥缺乏协同进化，相互适应性普遍较差，货架期也短。本发明从黑水虻肠道中分离得到的高效溶磷肺炎克雷伯氏菌(本发明中简称为lxr-1)，可利用黑水虻幼虫这一天然生物反应器发酵生产生物有机肥。由于菌与肥属于同位生产，相互之间充分协同互作，真正做到菌、肥自然一体，可有效提高功能菌在有机肥中的存活率和延长其货架期。
40.具体的，从黑水虻肠道中筛选lxr-1的方法如下：
41.富集：250ml三角瓶中加入50ml富集培养基，同时加入玻璃珠，1
×
105pa高压蒸汽灭菌21min。用接种环蘸取少量黑水虻肠道内容物加入富集培养基中，30℃、160r/min培养24h。
42.初筛：富集后取样稀释成系列浓度梯度10-6
、10-5
、10-4
、10-3
、10-2
，分别取每个稀释度的液体300μl涂布于筛选培养基固体平板上，倒置于30℃培养箱培养3-4d，观察透明圈。挑取有透明圈的菌落反复划线培养。
43.复筛：将纯化培养后的菌株接种于含有磷酸钙无机磷的液体培养基中，30℃、160r/min摇床培养6d。取2.0ml发酵液8000r/min离心10min，上清液用磷钼蓝比色法测定可溶性磷含量。
44.富集时采用的培养基成份如下：葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、氯化钠0.3g、氯化钾0.2g、硫酸铁0.03g、硫酸锰0.03g、磷酸钙5g、蒸馏水1000ml、ph值为6.5～7.0。115℃灭菌30min。
45.筛选时采用的培养基成份如下：葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化镁5g、硫酸镁0.25g、氯化钾0.2g、硫酸铵0.1g、蒸馏水1000ml、ph值为7.0。115℃灭菌30min。
46.具体的，可溶性磷含量的测定采用磷钼蓝分光光度法，其原理是磷酸根与钼酸铵在酸性条件下能够生成磷钼酸铵，而对二苯酚和亚硫酸钠能够将磷钼酸铵还原成蓝色的钼蓝，用分光光度计在660nm处测定钼蓝的吸光度计算磷含量。计算公式如下：x＝m
×
10/4v。式中，x为发酵液磷含量(mg/l)；m为从标准曲线查得的稀释发酵液中磷含量(mg/l)；v为吸取的稀释后发酵液体积(ml)。
47.经稀释平板涂布法从黑水虻肠道中分离纯化出150余株菌株，依据溶磷指数分别在固体有机磷筛选培养基和无机磷筛选培养基上进行初筛，共有10株菌株具有溶磷功能，
分别命名为bp-23、yx12、y4-12、y3-2、lxr-1、z2-1、z3-9、bl21、cb9、cb12。具体的溶磷菌lxr-1菌株的分离与筛选过程如图1所示。
48.将筛选出的10株溶磷菌接种到液体有机磷筛选培养基和无机磷筛选培养基中进行复筛，振荡培养7d后，检测发酵液中可溶性磷含量，结果如表1所示。从表1中可以看出，菌株lxr-1在有机磷筛选培养基中磷含量为43.38mg/l，无机磷筛选培养基中磷含量为320.83mg/l。这说明菌株lxr-1同时具有高效分解有机磷及无机磷的功能。
49.表1菌株溶磷菌溶磷能力
[0050][0051]
将lxr-1分离后，利用细菌dna提取试剂盒提取菌株的基因组dna，采用细菌16s rrna基因通用引物27f和1492r进行pcr扩增。
[0052]
27f的序列为：(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)见seq idno.3。详见seq id no.2
[0053]
1492r的序列为：(5
′‑
ggttaccttgttacgactt-3
′
)见seq idno.4。详见seq id no.3
[0054]
对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，pcr扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。得到长度为1501bp序列，将测序结果在ncbi上对比分析。比对结果如图2(a)所示，菌株lxr-1与klebsiella pneumoniae最相似，相似性达99.53％，选取与lxr-1相似的菌株16s rrna序列，用mafft进行多序列比对，然后用mega7构建nj进化树，从系统进化树上可以看出，lxr-1与klebsiella pneumoniae分枝聚在一起，基于16s rrna序列结果，初步鉴定菌株lxr-1为klebsiella pneumoniae。
[0055]
lxr-1的16s rdna序列如下：
[0056]
agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc
[0057]
ggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctggga
[0058]
aactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatgtcgca
[0059]
agaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagct
[0060]
agtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgacca
[0061]
gccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattg
[0062]
cacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgt
[0063]
aaagcactttcagcggggaggaaggcgttaaggttaataaccttggcgattgacgttacc
[0064]
cgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagc
[0065]
gttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaa
[0066]
tccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagagggg
[0067]
ggtagaattcgaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa
[0068]
ggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt
[0069]
agataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcg
[0070]
tggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa
[0071]
ctcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaa
[0072]
cgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgcct
[0073]
tcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttggg
[0074]
ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactc
[0075]
aaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcc
[0076]
cttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcga
[0077]
gagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactcca
[0078]
tgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggcc
[0079]
ttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaacc
[0080]
ttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaac
[0081]c[0082]
详见seq id no.1
[0083]
图2为lxr-1与ncbi的16s rrna序列库blastn比对结果。图2示了出了基于nj法构建的16s rrna系统进化树。
[0084]
进一步的，本发明根据《伯杰细菌鉴定手册》对菌株lxr-1进行生理生化鉴定。对分离纯化的lxr-1用api 20e生化鉴定条进行生理生化特征测定。api 20e是法国梅里埃公司根据酶促反应及代谢产物检测而研制的g-菌生化鉴定试剂条，api 20e细菌鉴定系统则为国际公认的标准鉴定系统。api 20e生化鉴定条检测步骤：1)将待检测菌株配成108cfu/ml菌悬液；2)将菌悬液滴加到api 20e试剂条各微量生化管内；3)37℃培养24h；4)滴加附加试剂进行显色，判断各生化管的反应结果是阳性还是阴性，并转化成相应的读数。用api lab软件进行分析鉴定。api 20e鉴定结果显示，菌株lxr-1鉴定的编号为5215773，鉴定为肺炎克雷伯氏菌，相似度大于98％。生化鉴定结果见表2。
[0085]
表2菌株lxr-1生理生化鉴定结果
[0086][0087]
本发明从黑水虻中分离得到的菌株lxr-1对磷源的分解能力很强。具体的，取1ml lxr-1菌液分别接种于5种采用不同磷源(磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、植酸钙、卵磷脂，添加量为0.5％)的磷源液体培养基中，每个摇瓶100ml，对照组为不接种培养基，每组实验3次生物学重复。30℃、100r/min培养6d，连续取样测定发酵液中的菌体量、磷含量和ph值。
[0088]
如图3所示，菌株lxr-1对5种难溶性磷源均具有一定的分解能力，但是对不同磷源的分解能力差异较大，lxr-1对磷酸钙的分解能力最强，远远强于对其他磷源的分解。其他
磷源培养液中可溶性磷含量均在100mg/l以内，对磷酸钙的分解能力明显较其他磷源强。磷酸钙培养液随着培养时间的延长，培养液中可溶性磷含量逐步上升，第5d达到最高，培养液中可溶性磷达320mg/l，但随后可溶性磷有所下降，原因可能是后期溶液中可溶性磷被菌体吸收而导致溶液中游离的磷元素变少。lxr-1在5种培养液中培养，培养液的ph值都是降低的，从最初的7.0左右，降到ph值3.2左右。发酵液中菌体含量以磷酸钙培养基最高，明显较其他磷源培养液高，在第3d达到平台期。这与对磷酸钙的分解能力最强相吻合，磷作为生物生命活动必需的大量元素，其生长、发育、繁殖等生命过程均需要消耗大量的磷元素，培养液中可溶性磷元素的多少便决定了发酵液中菌体的量。
[0089]
同时，初始ph值对菌株lxr-1的溶磷能力有所影响。如图4所示，初始ph值从3到9的情况下，lxr-1均能溶解磷酸钙。但是不同的初始ph值对lxr-1的溶磷能力影响较大。初始ph值为6.0时lxr-1对磷酸钙分解能力最强。初始ph值高于7.0或者低于5.0时，lxr-1对磷酸钙的分解较弱。当ph《8时，虽然初始ph不同，但最终发酵液的ph值均为3左右，而当初始发酵液为碱性(ph值为8和9)时，发酵6d后发酵液ph值分别为7.5和8.8，发酵液中的菌量也非常少，表明在碱性环境下，lxr-1菌体生长受到明显抑制，其原因可能是碱性环境下，可溶性磷酸根减少，导致培养液中可利用的磷变少，抑制了菌体的生长。菌体含量少，分泌的有机酸少，而少量的有机酸在碱性环境下易被中和掉，较难将难溶性磷溶解出来，从而导致碱性环境下，lxr-1生长受阻。过高或过低ph值对菌体生长均不利。
[0090]
菌株lxr-1之所以可以高效溶磷是菌株lxr-1中的葡萄糖酸激酶和磷酸酯酶共同作用的结果。
[0091]
如表3所示，lxr-1发酵液的ph值会持续下降，最终达3左右，这是发酵产生的有机酸导致的。精确称取各种有机酸标准品配制有机酸标样母液，使用流动相(1mmol/l h2so4+8mmol/l na2so4(ph值为2.8))配制100ml标准品母液，使用时取母液进行梯度稀释。色谱柱采用phenomenex luna c18-aq(5μm,4.6mmi.d.x 250mm)，柱温为30℃，流速1ml/min，检测波长210nm，进样量10μl，信噪比设为3。流动相使用前将其用0.22μm孔径的滤膜进行过滤。将lxr-1接种磷酸钙培养基，30℃、100r/min培养7d，连续取样测定发酵液中有机酸的含量。取2.0ml发酵液，在4℃、6000r/min条件下离心15min，吸取1.0ml上清液，用流动相稀释定容到25ml的容量瓶中，用0.22μm滤膜过滤，然后进行液相色谱分析。结果显示，lxr-1在发酵过种中产生多种有机酸，其中乙酸和葡萄糖酸含量最高，甲酸和乳酸次之。从发酵时间来看，这几种有机酸均随着发酵时间的延长而增加，但除了葡萄糖酸和乙酸外，其他有机酸增长速度较缓慢，维持在低浓度水平。葡萄糖酸在第3d便达到平台期，达到了4562.14mg/l。而丁二酸在第3d才开始产生，但随后便呈增加趋势。lxr-1溶解无机磷主要机理是产生有机酸，从发酵液中的有机酸种类推测，其中起主要作用的是葡萄糖酸和乙酸。
[0092]
有机酸1d(mg/l)3d(mg/l)5d(mg/l)7d(mg/l)葡萄糖酸1932.324562.144782.354873.67甲酸147.21151.25156.63158.33乙酸1962.532313.562451.552673.82酒石酸61.4367.8968.8871.11苹果酸48.2553.6657.4259.36柠檬酸81.6585.3387.9092.45
丁二酸019.2341.3384.15丙酸28.4339.4840.1242.76丁酸63.1467.8769.0373.54乳酸90.75122.90142.05156.21
[0093]
磷酸酯酶(phosphatase)是水溶磷酸酯及多聚磷酸化合物酶类的总称，是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水溶磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如atp，将磷酸基团加到对应底物分子上。将lxr-1接种磷酸钙培养基，30℃、100r/min培养7d，连续取样测定发酵液中磷酸酯酶活性。取发酵好的培养液2.0ml，在4℃、6000r/min条件下离心15min，取0.5ml上清液于具塞比色管中，加入mub缓冲液(酸性磷酸酯酶用ph＝6.5缓冲液，碱性磷酸酯酶用ph＝11.0缓冲液)4.0ml，再加入1.0ml对硝基苯酚磷酸钠溶液，盖上盖子混匀置于37℃水浴锅1h，加入氯化钙溶液1.0ml和氢氧化钠溶液4.0ml混匀后过滤，在400nm处测吸光度。空白对照为不接种的培养液。每个样品测5次重复。如图5所示，在磷酸钙培养基中lxr-1的酸性磷酸酯酶酶活要高于碱性磷酸酯酶的酶活，在第3d时2种酶活均达到最高，酸性磷酸酯酶活性达到162.37μmol/(g
·
h)，碱性磷酸酯酶活性达到87.81μmol/(g
·
h)。前3d两种磷酸酯酶酶活在培养基中的活性都增长迅速，第4天之后2种酶活的活性持续下降。在lxr-1基因组中，一共存在107个磷酸酶，对这107个磷酸酶进一步进行了pfam结构域分析，发现有24个基因与卤酸脱氢酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase)相关，但这24个基因均不含有分泌信号肽。在这107个磷酸酶中，经signalp预测，有12个具有信号肽，进一步用deeploc进行亚细胞定位分析，有9个磷酸酶定位于胞外，其中包括6个酸性磷酸酶，2个碱性磷酸酶和1个金属磷酸酶。lxr-1发酵液呈酸性，最终ph值趋于3左右，酸性磷酸酶在酸性环境下活性最强，lxr-1发泌的有机酸可为其提供合适的酸性条件。这些胞外磷酸酶可将环境中的有机磷分解出来被植物吸收。
[0094]
表4 lxr-1胞外磷酸酶编码基因
[0095][0096]
菌株lxr-1菌的葡萄糖醛酸合成途径与一般的菌株也存在差别。
[0097]
细菌利用葡萄糖一般是通过pts系统(phosphoenolpyruvate dependent glucose phosphotransferase system(pts))进行的，但某些enterobacteriaceae，包括k.pneumoniae存在另外一条葡萄糖利用通路。其先在胞外将葡萄糖氧化为葡萄糖酸(gluconate)，葡萄糖酸能通过葡萄糖酸转运蛋白(gluconate transporter)从胞外转运到胞内，在葡萄糖酸激酶(gluconate kinase)的作用下形成磷酸化葡萄糖酸，然后进入丙酮
酸途径。
[0098][0099]
菌株lxr-1发酵液中含有大量葡萄糖酸，在菌株lxr-1基因组中也鉴定到了葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase)lxr-1_04128，葡萄糖脱氢酶可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，葡萄糖酸在葡萄糖酸脱氢酶(gluconate2-dehydrogenase)作用下变成2-葡萄糖醛酸(2-ketogluconic acid)。
[0100]
lxr-1葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如下：
[0101]
maetksqqsrllvtltalfaafcglylliggawlvvlggswyypia
[0102]
glvmlgvtvmlfrg
[0103]
kraalwlyaalllatmiwgvwevgfdcwaltprsdilvffgiwlil
[0104]
pcvwrrlpvpsaga
[0105]
valvvallisggmltwagfndpqevngtlsadatpaapistvadgd
[0106]
wpaygrnqegqrfs
[0107]
plkqinadnvknlkeawvfrtgdlkqpndpgeitnevtpikvgdsl
[0108]
flctahqrlfldaa
[0109]
tgkekcssdpqlnadpsfqhvtcrgvsyheakadnapadvvadcp
[0110]
rriilpvndgrlfav
[0111]
nadngklcetfankgilnlqtnmpvttpgmyeptsppiitdktivia
[0112]
gavtdnfstreps
[0113]
gvirgfdvntgkllwafdpgakdpnaipsdehhftlnspnswapaa
[0114]
ydakldlvylpmgv
[0115]
ttpdiwggnrtpeqeryassivalnattgklawsyqtvhhdlwdm
[0116]
dmpsqptladievng
[0117]
ktvpviyapaktgnifvldrrngelvvpapekpvpqgaakgdyvtk
[0118]
tqpfsdlsfrpkkd
[0119]
ltgadmwgatmfdqlvcrvifhqlryegiftppseqgtlvfpgnlg
[0120]
mfewggisvdpnrq
[0121]
vaianpmalpfvskliprgpgnpmeppkdakgsgtesgvqpqygvp
[0122]
ygvtlnpflspfgl
[0123]
pckqpawgyisaldlktnevvwkkrigtpqdslpfpmpvklpftmg
[0124]
mpmlggpistagnv
[0125]
lfigatadnylraynmsngeklwearlpaggqatpmtyevngkqy
[0126]
vvisagghgsfgtkm
[0127]
gdyivayalpddak
[0128]
详见seq id no.4
[0129]
lxr-1葡萄糖脱氢酶lxr-1_04128位于细胞膜上，经tmhmm分析(葡萄糖脱氢酶跨膜结构域如图6所示)，在n端含有5个跨膜结构域，另外，在c端可能还含有2个跨膜结构域。葡萄糖酸脱氢酶亚细胞定位deeploc预测结果如图7所示。deeploc分析结果表明葡萄糖脱氢酶位于胞外。这些胞外的磷酸酶与葡萄糖脱氢酶是lxr-1具有很强的溶磷能力的原因。
[0130]
相对与其他肺炎克雷伯氏菌，本发明提供的菌株lxr-1具有更强的溶磷能力。以cg43为例，菌株lxr-1与cg43均为肺炎克雷伯氏菌(如图8(a)所示)，但其溶磷能力差异较大，测量发酵液中有机酸的含量时发现，发酵7d后，菌株cg43发酵液中葡萄糖酸的含量为234.76mg/l，显著低于菌株lxr-1的4873.67mg/l。比较两个菌株葡萄糖脱氢酶序列，发现在菌株lxr-1中，葡萄糖脱氢酶存在两个丙氨酸(a)的缺失(如图8b所示)，而这两个位置的丙氨酸在其他肠杆菌(enterobacteriaceae)和k.pneumoniae中均存在。图8b中示出的葡萄糖脱氢酶的序列表中可以看出，lxr-1中葡萄糖脱氢酶存在两个丙氨酸(a)的缺失。这也是lxr-1溶磷能力的明显增强的原因(如图8c所示)。
[0131]
菌株cg43葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如下：
[0132]
maetksqqsrllvtltalfaafcglylliggawlvvlggswyypia
[0133]
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[0134]
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[0135]
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[0136]
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[0137]
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[0138]
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[0139]
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[0140]
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[0141]
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[0142]
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[0143]
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[0144]
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[0145]
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[0146]
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[0147]
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[0148]
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[0149]
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[0150]
lfigatadnylraynmsngeklwearlpaggqatpmtyevngkqy
[0151]
vvisagghgsfgtkmgdyivayalpddak
[0152]
详见seq id no.5
[0153]
为验证lxr-1葡萄糖脱氢酶功能，先将lxr-1_04128基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pet-28a(+)-sumo上，转化大肠杆菌dh5α，经pcr验证阳性克隆子，将其接种到磷酸钙平板，结果显示，阳性转化子可看到明显的溶磷圈，而原始大肠杆菌dh5α则没有溶磷圈(如图9所示)。
[0154]
lxr-1为兼性好氧菌，其能在黑水虻肠道中较好增殖。分别取黑水虻3-5龄幼虫的
前肠、中肠和后肠内容物，提取dna，用设计的lxr-1特异性引物，经实时荧光qpcr和标准曲线计算lxr-1菌在黑水虻肠道不同部位的含量。结果表明，lxr-1含量最高的为后肠，含量达到1.5
·
108cfu/g，其次为中肠，前肠较少。这一分布特征也表明lxr-1能在黑水虻肠道中大量有效增殖，且在虫粪中检测到大量lxr-1，菌含量达1.3-2.1
·
108cfu/g。
[0155]
菌株lxr-1在虫沙中的存活率也非常高。将虫沙风干至含水量25％～30％，用自封袋室温保存，分别于30d、60d、90d、180d和360d后分别用平板分离法和qpcr法检测lxr-1菌的含量。结果表明，lxr-1在180d之前存活率一直保持在75％以上，180d后有所下降，360d后菌存活率依然在52％以上。这说明菌侏lxr-1的虫沙适宜长期保存。
[0156]
由于菌株lxr-1具有很强的溶磷能力，所以其可促进植株的生长。以下以小白菜(brassica campestris l.ssp.chinensis makino)为例对菌株lxr-1的促生作用进行说明。
[0157]
将保存的溶磷菌lxr-1接种于15ml种子液培养基中，培养12h。按1％接种量在扩繁培养基中扩大培养，30℃培养24h后得菌液。将菌液6000r/min离心15min后用无菌水重复离心冲洗2次。然后用无菌水稀释得到的菌体，使菌液中菌体数量为108cfu/ml备用。
[0158]
去除表层土壤，取用耕层5-20cm的土壤(ph＝6.46，有效磷6.8mg/kg，速效钾62.1mg/kg碱解氮98.7mg/kg，有机质21.1mg/kg)，将土壤风干粉碎至合适大小后，填入花盆中(口径140mm，高115mm)，每盆装入土壤650g，共12盆。将12盆盆栽随机分成4组：处理1(ck)，施用氮肥+钾肥+ca3(po4)2；处理2(p1)，施用氮肥+钾肥+ca3(po4)2+溶磷菌剂2
×
109cfu/盆；处理3(p2)，施用氮肥+钾肥+ca3(po4)2+溶磷菌剂4
×
109cfu/盆；处理4(p3)，施用氮肥+钾肥+ca3(po4)2+溶磷菌剂6
×
109cfu/盆。所用氮肥为尿素(用量为320.0mg/kg)，钾肥选用氯化钾(277.0mg/kg)，磷肥选用ca3(po4)2(用量为1500.0mg/kg)。土壤与肥料混合均匀后装盆，适当浇水，向每盆中播撒大小相似的白菜种子6颗，待4d发芽后间苗至2颗，待其过两叶期(10d)后，再向苗根部播撒菌液。30d后待其生长成熟，测定小白菜的理化性质，先收割小白菜的地上部，然后收割小白菜，将小白菜上泥点洗净，测定株高与鲜重，再放入烘干箱105℃杀青30min，80℃烘干至恒重，磨碎后放入自封袋中备用，通过h2so
4-h2o2消煮法处理小白菜叶片，然后通过钼锑抗比色法测定叶片磷含量。
[0159]
结果如图10所示，添加lxr-1菌菌剂明显促进了小白菜的生长，提高了株高、鲜重和叶片磷含量，其中处理p2促进作用最明显，表明溶磷菌剂为4
×
109cfu/盆时促生效果最显著。
[0160]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。