一种奥芬达唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用与流程

本发明属于食品安全检测，具体涉及一种奥芬达唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、奥芬达唑是一种新型的高效、广谱、低毒的苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物，已被广泛用于兽医生产中，如防治胃肠道线虫、肺线虫、肝吸虫等。由于奥芬达唑在动物的安全评价试验中表现出具有致畸和致突变性，因此中国、美国、欧盟等大多数国家或地区将其作为食品安全重要的监控对象，并制订了最高残留限量。

2、目前，有关测定奥芬达唑残留的方法，主要有气相色谱质谱法（gc-ms）、高效液相色谱法（hplc）以及液相色谱串联质谱法（lc-ms/ms）等，hplc法具有定量准确等优点，但在检测时前处理相对复杂，在实际应用中存在方法灵敏度低等缺点。gc-ms法可进行确证检测且灵敏度高，但前处理过程复杂，需进行衍生化处理。lc-ms/ms法具有灵敏度高、选择性好、定性定量准确、抗干扰能力强等优点，但该方法也存在前处理过程复杂，耗时比较长、成本高等缺点。

3、免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。因此，急需制定一种快速准确的、用于筛选大批量的动物性食品的快速检测方法来改善现状，填补国内检测手段的缺失，提升并规范整个检测行业的技术水平，增强我国动物性食品在国际市场上的竞争力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供奥芬达唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

2、本发明所提供的奥芬达唑人工抗原是在奥芬达唑半抗原的基础上构建所得的抗原。

3、所述奥芬达唑半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式i所示。

4、

5、式i

6、本发明所提供的制备所述奥芬达唑半抗原的方法，具体可包括如下步骤：

7、2-甲氧基羰基氨基-3h-苯并咪唑-5-羧酸加入二甲基甲酰胺（dmf）搅拌后，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-溴代琥珀酰亚胺（nbs）搅拌，加入4-(氨甲基)苯甲酸反应，反应液萃取、旋干、层析、再旋干获得固体1。所述2-甲氧基羰基氨基-3h-苯并咪唑-5-羧酸、二甲基甲酰胺（dmf）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-溴代琥珀酰亚胺（nbs）和4-(氨甲基)苯甲酸的配比为500mg:5ml:448mg:269mg:446mg。

8、在奥芬达唑半抗原的基础上构建所得的奥芬达唑抗原也属于本发明的保护范围。

9、所述奥芬达唑抗原，为将所述奥芬达唑半抗原（式i）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（bsa）或卵清蛋白（ova）。

10、所述奥芬达唑抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。

11、所述奥芬达唑抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述奥芬达唑半抗原（式i）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述奥芬达唑抗原。

12、在本发明中，所述奥芬达唑抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：

13、（1）将所述奥芬达唑半抗原（式i）溶解于二甲基甲酰胺（dmf）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液i；

14、其中，所述奥芬达唑半抗原（式i）、所述二甲基甲酰胺（dmf）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、所述n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的配比为13.73mg:1.5ml:21.5mg:13mg。

15、（2）将所述载体蛋白置于0.1m碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液ii；所述载体蛋白与所述0.1m碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg:3.5ml；

16、其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（bsa），则所述牛血清白蛋白（bsa）与所述0.1m碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白（ova），则所述卵清蛋白（ova）与所述0.1m碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5ml；

17、（3）将所述溶液i和所述溶液ii混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液i逐滴加入到所述溶液ii中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液iii；

18、（4）用磷酸盐缓冲液（0.01m pbs，ph7.2），于4℃对所述溶液iii搅拌透析3天，得到所述奥芬达唑抗原。

19、所述奥芬达唑半抗原（式i）或所述奥芬达唑抗原在定性或定量检测奥芬达唑中的应用也属于本发明的保护范围。

20、利用所述奥芬达唑抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。

21、本发明所提供的奥芬达唑半抗原，以及所述奥芬达唑抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于奥芬达唑抗体的制备，以及奥芬达唑残留检测具有重大价值。

技术特征：

1.一种化合物，其结构如式i所示：

2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：

3.奥芬达唑抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。

4.根据权利要求3所述的奥芬达唑抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的奥芬达唑抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述奥芬达唑抗原。

6.根据权利要求5所述的奥芬达唑抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

7.权利要求1所述化合物或权利要求3所述奥芬达唑抗原的应用，其特征在于定性或定量检测奥芬达唑；制备奥芬达唑抗体。

8.利用权利要求3所述奥芬达唑抗原制备的抗体，其特征在于所述抗体为抗奥芬达唑单克隆抗体；所述抗奥芬达唑单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为序列表的序列1所示；所述抗奥芬达唑单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列表的序列2所示。

9.根据权利要求3所述的奥芬达唑抗原，其特征在于可以用于制备酶联免疫试剂盒和胶体金检测卡。

10.根据权利要求9所述的奥芬达唑抗原，其特征在于所述酶联免疫试剂盒和胶体金检测卡检测样本可以为乳品和组织，所述检测上述样本中奥芬达唑的检测限为5μg/kg，灵敏度为0.20μg/l。

技术总结
本发明公开了一种奥芬达唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的奥芬达唑人工抗原为将式I所示的奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供奥芬达唑人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于奥芬达唑抗体的制备，以及奥芬达唑药物残留检测具有重大价值。式I。

技术研发人员：马立才,吕顺全,李蓉蓉,覃丹凤,邢维维,贾良曦
受保护的技术使用者：北京维德维康生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13