一种与芹菜叶柄白色性状紧密连锁的分子标记及其应用

1.本发明涉及生物技术领域中，一种与芹菜叶柄白色性状紧密连锁的分子标记及其应用。


背景技术：

2.芹菜(apium graveolens l.)别名旱芹、药芹等，是伞形科芹属二年生蔬菜作物，染色体数为2n＝2x＝22，四季均可生产，在中国有悠久的栽培历史，广泛分布于全国各地。目前我国生产应用的芹菜品种主要有本芹、西芹，本芹与西芹的杂交改良型以及少量的根芹。近年来，优质、高产、抗病、专用型新品种芹菜的推广速度已逐步加快，一些地方性特色品种在市场中的占有量逐渐增加，而在各地大面积推广的改良型实芹类品种的种植面积却逐渐减少。
3.近十年来，我国芹菜种植面积相对稳定，保持在55万hm2左右，其中山东、河南地区种植面积最大，分别达到7.1万hm2和5.5万hm2。随着我国各个地区栽培技术、设施水平的提高和市场消费需求的变化，芹菜种植方式由最初的露地栽培演变为塑料拱棚栽培，现已发展为日光温室栽培，其生产方式多采用播种育苗之后再定植的形式。目前，在我国现有的芹菜品种中，芹菜的叶柄颜色可分为紫色、黄色、浅绿、绿色和白色，从分布来看，白色叶柄芹菜主要分布在云南、四川、贵州、广西等地，其特点是植株矮小，叶柄纤细，多数中空，纤维较多，药香味强。
4.叶柄是芹菜的主要食用器官，叶柄颜色会影响芹菜的品质，但是到目前为止关于芹菜叶柄颜色控制基因的报道非常少，申请人前期通过以白色叶柄芹菜和绿色叶柄芹菜为亲本构建f2分离群体，发现白色叶柄对绿色叶柄为显性且受一个单基因控制，开发了一个和白色叶柄连锁的srap标记
‑‑
e67m59，但该标记为一个显性标记，无法区分杂合和显性纯合白色单株，且连锁距离较远。因此开发和白色叶柄连锁距离更为紧密的共显性分子标记不仅能够提高芹菜的育种效率，同时也能为芹菜叶柄性状的改良提供一定的参考依据。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何检测芹菜叶柄颜色。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测芹菜叶柄颜色分子标记的物质在检测或辅助检测芹菜叶柄颜色性状中的应用，所述芹菜叶柄颜色分子标记为seq id no.3所示的dna片段和seq id no.4所示的dna片段。
7.上述应用中，所述检测芹菜叶柄颜色分子标记的物质可为由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对。
8.本发明还提供了检测芹菜叶柄颜色性状的方法，所述方法包括：以待测芹菜的基因组dna为模板，利用由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，所得pcr产物序列为seq id no.3的纯合芹菜的叶柄颜色为或候选绿色，所得pcr产物序列为seq id no.4的纯合芹菜的叶柄颜色为或候选为白色，所得pcr产物序
列为seq id no.3和seq id no.4的杂合芹菜的叶柄颜色为或候选为白色。
9.本发明还提供了检测芹菜叶柄颜色性状的方法，所述方法包括：以待测芹菜的基因组dna为模板，利用由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，所得pcr产物大小为163bp的纯合芹菜的叶柄颜色为或候选绿色，所得pcr产物大小为159bp的纯合芹菜的叶柄颜色为或候选白色，所得pcr产物大小为163bp和159bp的杂合芹菜的叶柄颜色为或候选白色。
10.本发明还提供了芹菜育种方法，所述方法包括：以待测芹菜的基因组dna为模板，利用由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，选择pcr产物含有seq id no.4或pcr产物含有seq id no.3和seq id no.4的待测芹菜作为亲本完成育种。
11.上文中，利用由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增的反应体系可为：0.5μl浓度为10μmo1/l的seq id no.1所示的单链dna；0.5μl浓度为10μmo1/l的seq id no.2所示的单链dna；2μl基因组dna；10μl 2
×
es taq mastermix(dye)；ddh2o将总体积补齐至20μl。
12.利用由序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增的反应条件可为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
13.本发明还提供了所述检测芹菜叶柄颜色分子标记的物质在制备检测芹菜叶柄颜色性状产品中的应用。
14.本发明还提供了所述芹菜叶柄颜色分子标记在检测或辅助检测芹菜叶柄颜色性状中的应用。
15.本发明还提供了所述芹菜叶柄颜色分子标记在芹菜育种中的应用。
16.本发明的实验表明，本发明的芹菜叶柄颜色分子标记可以鉴定芹菜叶柄颜色：利用seq id no.1和seq id no.2所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增，所得pcr产物含有seq id no.4所示dna片段、且不含seq id no.3所示dna片段的芹菜叶柄为白色，所得pcr产物既含有seq id no.4所示dna片段、也含有seq id no.3所示dna片段的芹菜叶柄为白色，所得pcr产物含有seq id no.3所示dna片段、且不含seq id no.4所示dna片段的芹菜叶柄为绿色。本发明的芹菜叶柄颜色分子标记鉴定芹菜叶柄颜色具有很高的准确率，具有很好的应用前景。
17.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
18.图1为w121x引物在白色叶柄亲本、绿色叶柄亲本和二者杂交f1代扩增胶图。注：a：上带，绿色叶柄芹菜亲本ce82l；b：下带，白色叶柄芹菜亲本ce72w，h：杂合，白色叶柄亲本和绿色叶柄亲本杂交f1代。
19.图2为w121x与芹菜白色叶柄基因wh的遗传距离(0.4cm)。
20.图3为44份已知芹菜叶柄颜色材料对w121x的验证。注：a：上带，绿色叶柄；b：下带，
白色叶柄，h：杂合，白色叶柄。
具体实施方式
21.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
22.下述实施例中的芹菜白色叶柄亲本ce72w和芹菜绿色叶柄亲本ce82l均记载在“han q,wang s,yang wc,shen hl(2012).inheritance of white petiole in celery and development of a tightly linked scar marker.plant breeding,131(2):340-344”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
23.实施例1、
24.一、分子标记w121x的获得
25.1.定位群体的构建
26.本试验以芹菜白色叶柄亲本ce72w和芹菜绿色叶柄亲本ce82l构建的f2群体21q68为试验材料，21q68群体大小为461株，单株统计叶柄颜色，群体中白色叶柄单株数为345株，绿色叶柄单株数为116株。芹菜基因组dna的提取采用改良ctab法。
27.2.分子标记开发
28.对芹菜白色叶柄亲本ce72w、芹菜绿色叶柄亲本ce82l、f2群体21q68中白色叶柄单株(30株)和绿色叶柄单株(30株)进行bsa重测序，根据重测序结果开发相关分子标记。
29.3.分子标记w121x的获得
30.根据bsa重测序关联的结果，在4号染色体上进行引物设计，以芹菜白色叶柄亲本ce72w、绿色叶柄亲本ce82l、白色叶柄混池(从f2群体21q68中挑选30株白色叶柄进行混池)和绿色叶柄混池(从f2群体21q68中挑选30株绿色叶柄进行混池)为模板进行多态性引物筛选，经过筛选，发现分子标记w121x在上述亲本和混池间具有稳定的多态性，且该标记的引物pcr所扩增出的条带清晰，差异明显(图1)。具体为：白色亲本基因组dna扩增产物为159bp的片段，在绿色叶柄亲本dna扩增产物为163bp的片段，在白色叶柄混池dna扩增产物为159bp和163bp的片段，在绿色叶柄混池dna扩增产物为163bp的片段。经测序，所得163bp的扩增产物的序列均为(seq id no.3)，所得159bp的扩增产物的序列均为(seq id no.4)。
31.引物序列如下所示：
32.w121x-f：5
’‑
gatctactagtgttcttacgagc-3’(seq id no.1)；
33.w121x-r：5
’‑
actctctaggggaatgaactataag-3’(seq id no.2)。
34.pcr扩增体系：基因组dna 2μl、10μl 2
×
estaq mastermix(dye)(北京康为世纪；货号：cw0690l)、w121x-f和w121x-r各0.5μl(10μm)，用7μl ddh2o将总体积补齐至20μl；
35.pcr扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
36.w121x扩增序列：
37.a：上带(163bp的扩增产物)：
38.gatctactagtgttcttacgagcatgtgtatcattattgtgggatgtactatgtgagtgtgtgtgtgtgtgtgtgttagtcgctaaacacacgctaaaatacacgcaaatatacgcgttcataagtaatatataatatcttatagttcattcccctagagagt(seq id no.3)；
39.b：下带(159bp的扩增产物)：
40.gatctactagtgttcttacgagcatgtgtatcattattgtgggatgtactatgtgagtgtgtgtgtgtgtgttagtcgctaaacacacgctaaaatacacgcaaatatacgcgttcataagtaatatataatatcttatagttcattcccctagagagt(seq id no.4)。
41.pcr产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对pcr扩增产物进行测序。
42.4.遗传连锁分析
43.利用筛选所得的多态性分子标记w121x分析f2群体21q68的461个单株的基因型，并结合f2群体21q68叶柄颜色表型鉴定结果，结果表明：分子标记w121x与白色叶柄基因的连锁距离为0.4cm(图2)。
44.将扩增产物中含有159bp的dna片段、不含有163bp的dna片段的纯合芹菜记为bb基因型芹菜，将扩增产物中含有163bp的dna片段、不含有159bp的dna片段的纯合芹菜记为aa基因型芹菜，将扩增产物中既含有163bp的dna片段、又含有159bp的dna片段的杂合芹菜记为ab基因型芹菜。
45.f2群体21q68的461个单株中，aa基因型芹菜共有116株，叶柄颜色除一株为白色外，其余均为绿色；bb基因型芹菜共有115株，叶柄颜色均为白色；ab基因型芹菜共有230株，叶柄颜色除一株为绿色外，其余均为白色，表1-表4。
46.上述结果表明，多态性分子标记w121x为芹菜叶柄颜色分子标记，利用该分子标记可以鉴定芹菜叶柄颜色：利用w121x-f与w121x-r组成的引物对进行pcr扩增，所得pcr产物含有seq id no.4所示dna片段、且不含seq id no.3所示dna片段的芹菜叶柄为白色，所得pcr产物既含有seq id no.4所示dna片段、也含有seq id no.3所示dna片段的芹菜叶柄为白色，所得pcr产物含有seq id no.3所示dna片段、且不含seq id no.4所示dna片段的芹菜叶柄为绿色。
47.表1、f2群体21q68基因型与表型的鉴定结果
[0048][0049][0050]
表2、f2群体21q68基因型与表型的鉴定结果
[0051][0052][0053]
表3、f2群体21q68基因型与表型的鉴定结果
[0054][0055][0056]
表4、f2群体21q68基因型与表型的鉴定结果
[0057][0058][0059]
注：表1-表4中，h：ab杂合基因型；b：bb基因型；a：aa基因型。
[0060]
二、分子标记w121x的应用
[0061]
1.试验材料
[0062]
利用44份已知叶柄颜色芹菜材料(表5)，对分子标记w121x进行验证。所用芹菜材料可从中国农业大学园艺学院获得。
[0063]
表5、w121x在44份芹菜中的验证结果
[0064]
[0065][0066]
2.试验方法
[0067]
利用分子标记w121x对上述供试材料进行基因型检测，模板为上述供试材料的基因组dna。pcr扩增体系与条件同步骤一。
[0068]
3.试验结果
[0069]
利用标记w121x对实验室保存的44份已知叶柄颜色的芹菜材料进行基因型检测。结果显示，44份自交系材料用w121x标记验证的成功率为95.5％(图3)；表明这个标记的适用性很强，育种实际应用中可以利用此标记对芹菜叶柄颜色进行快速鉴定。
[0070]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。