抗体和其使用方法与流程

本发明关于特异性地结合人类糖皮质素诱导tnfr家族相关受体(gitr)和/或人类ox40受体(「ox40」)的多特异性抗体，例如双特异性抗体；包含这类抗体的组合物；以及产生和使用那些抗体的方法。

背景技术：

1、先天性免疫反应及适应性免疫反应在控制人体肿瘤生长的作用已经良好表征(vesely md等人,(2011)annu rev immunol 29:235-271)。因此，基于抗体的策略已出现，旨在增强用于癌症治疗目的的t细胞反应，诸如使用促效剂抗体靶向t细胞表达的刺激性受体、或使用功能性拮抗剂靶向t细胞表达的抑制性受体(mellman i等人,(2011)nature480:480-489)。抗体介导的促效剂和拮抗剂方法已显示临床前活性和近期的临床活性。

2、免疫反应的两种重要的刺激因子为糖皮质素诱导tnfr相关蛋白(gitr)和ox40受体(「ox40」)。gitr和ox40皆为肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的成员。

3、gitr(亦称为活化诱导型tnfr家族受体(aitr)、gitr-d、cd357和肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tnfrsf18))表达于先天性免疫系统和适应性免疫系统的许多组分且刺激后天免疫和先天免疫两者(nocentini g等人,(1994)pnas 94:6216-6221；hanabuchi s等人,(2006)blood 107:3617-3623；nocentini g和riccardi c(2005)eur j immunol 35:1016-1022；nocentini g等人,(2007)eur j immunol 37:1165-1169)。gitr表达于若干细胞和组织，包括t细胞、b细胞、树突细胞(dc)和自然杀手细胞(nk)，且由其配体gitrl活化，配体gitrl主要表达于抗原呈现细胞(apc)、内皮细胞和肿瘤细胞。gitr/gitrl统参与自体免疫/发炎反应的发展且加强对感染和肿瘤的反应。举例而言，使用gitr-fc融合蛋白治疗动物改善自体免疫/发炎性疾病，而gitr触发可有效治疗病毒感染、细菌感染和寄生物感染且增强对抗肿瘤的免疫反应(nocentini g等人,(2012)br j pharmacol 165:2089-99)。这些作用归因于若干个并行机制，包括：效应t细胞的共活化、对调节性t(treg)细胞的抑制、nk细胞共活化、巨噬细胞的活化、树突细胞功能的调节和外渗过程的调节。在t细胞活化的后，gitr的膜表达增加(hanabuchi s等人,(2006)(同上)；nocentini g和riccardi c(同上))。gitr触发会共活化效应t淋巴球(mchugh r s等人,(2002)immunity 16:311-323；shimizu j等人,(2002)nat immunol 3:135-142；roncheti s等人,(2004)eur j immunol34:613-622；tone m等人,(2003)pnas 100:15059-15064)。gitr活化增加对肿瘤和病毒感染的抵抗力，涉和自体免疫/发炎过程且调节白血球外渗(nocentini g和riccardi c(2005)(同上)；cuzzocrea s等人,(2004)j leukoc biol 76:933-940；shevach e m和stephens g l(2006)nat rev immunol 6:613-618；cuzzocrea s等人,(2006)j immunol177:631-641；cuzzocrea s等人,(2007)faseb j 21:117-129)。

4、人类gitr以极低的量表达于周边(未活化)t细胞。在t细胞活化的后，在cd4+细胞和cd8+细胞两者中，gitr经强烈上调达数日(kwon b等人,(1999)j biol chem 274:6056-6061；gurney al等人,(1999)curr biol 9:215-218；ronchetti s等人,(2004)(同上)；shimizu j等人,(2002)(同上)；ji h b等人,(2004)(同上)；ronchetti s等人,(2002)blood 100:350-352；li z等人,(2003)j autoimmun 21:83-92)，cd4+细胞比cd8+细胞具有更高的gitr表达(kober j等人,(2008)eur j immunol 38(10):2678-88；bianchini r等人,(2011)eur j immunol 41(8):2269-78)。

5、ox40(亦称为cd134、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)、txgp1l、act35和act-4)调节t细胞、自然杀手t(nkt)细胞和nk细胞功能(sugamura k等人,(2004)nat revimmunol 4:420-431)。ox40可由抗原特异性t细胞在显示负载同源肽的mhc i类或ii类分子的专职抗原呈现细胞(apc)刺激t细胞受体(tcr)的后上调(sugamura k等人,(2004)natrev immunol 4:420-431)。在成熟时，诸如树突细胞(dc)的apc上调刺激性b7家族成员(例如cd80和cd86)和包括ox40配体(ox40l)的辅助共刺激分子，其上调有助于塑造t细胞免疫反应的动力学和量级以及有效的记忆细胞分化。值得注意的是，其他细胞类型亦可表达组成性和/或诱导性ox40l的含量，诸如b细胞、血管内皮细胞、肥大细胞和在一些情况下经活化的t细胞(soroosh p等人,(2006)j immunol 176:5975-5987)。咸信ox40:ox40l共接合驱动受体三聚体的更高层级的簇集和后续的信号转导(compaan dm等人,(2006)structure14:1321-1330)。

6、已在鼠类和人类肿瘤组织中观测到在肿瘤微环境内t细胞表达ox40(bulliard y等人,(2014)immunol cell biol 92:475-480；和piconese s等人,(2014)hepatology 60:1494-1507)。相对于习知的t细胞群组体，调节性t细胞(treg)的肿瘤内群组体高度表达ox40，此为归因于肿瘤内treg群组体的增殖状态特征(waight j d等人,(2015)jimmunol194:878-882；和bulliard y等人,(2014)immunol cell biol 92:475-480)。早期研究证实ox40促效剂抗体能够在小鼠模型中引出肿瘤排斥反应(weinberg a d等人,(2000)jimmunol 164:2160-2169；和piconese s等人,(2008)j exp med 205:825-839)。促效人类ox40信号传导的小鼠抗体亦已显示可增强癌症患者的免疫功能(curti b d等人,(2013)cancer res 73:7189-7198)。

7、ox40与ox40l的相互作用亦已与发炎性和自体免疫性疾病和病症的免疫反应相关，气喘/特异反应、脑脊髓炎、类风湿性关节炎、结肠炎/发炎性肠病、移植物抗宿主病(例如移植排斥反应)、非肥胖糖尿病小鼠的糖尿病和动脉粥样硬化的小鼠模型(croft m等人,(2009)immunol rev 229(1):173-191和其中引用的参考文献)。已经报道在ox40和ox40l缺陷型小鼠、接受负载细胞抑制药物的抗ox40脂质体的小鼠和使用抗ox40l阻断抗体或与人类免疫球蛋白的fc部分融合的重组ox40阻断ox40与ox40l的相互作用的小鼠中与所述疾病和病症相关的症状减少(croft m等人；boot epj等人,(2005)arthritis res ther 7:r604-615；weinberg a d等人,(1999)j immunol 162:1818-1826)。亦显示使用阻断性抗ox40l抗体的治疗可抑制恒河猴气喘模型的th2发炎(croft m等人；seshasayee d等人,(2007)j clin invest 117:3868-3878)。此外，ox40l的多态性已与狼疮相关(croft m等人)。

8、鉴于人类gitr和ox40在调节免疫反应的角色，本发明提供特异性地结合gitr和/或ox40的抗体和这些抗体调节gitr和/或ox40活性的用途。

技术实现思路

1、在一个态样中，本发明提供结合gitr和/或ox40的多特异性(例如双特异性)抗体。在一种情况下，分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含特异性地结合ox40(例如人类ox40)的第一抗原结合域和特异性地结合gitr(例如人类gitr)的第二抗原结合域。

2、在一种情况下，抗体包含特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域和tnf超家族蛋白质。在一种情况下，抗体包含tnf超家族蛋白质和特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域。tnf超家族蛋白质可置换本发明提供的任何多特异性(例如双特异性)抗体的第一抗原结合域或第二抗原结合域。

3、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域，包含：(i)包含氨基酸序列gsamh(seq idno:47)的重链可变域(vh)互补决定区(cdr)1；(ii)包含氨基酸序列rirskansyatayaasvkg(seq id no:48)的vh-cdr2；(iii)包含氨基酸序列giydssgydy(seq id no:49)的vh-cdr3；(iv)包含氨基酸序列rssqsllhsngynyld(seq id no:50)的轻链可变域(vl)-cdr1；(v)包含氨基酸序列lgsnras(seq id no:51)的vl-cdr2；以及(vi)包含氨基酸序列mqgskwplt(seqid no:52)或mqalqtplt(seq id no:53)的vl-cdr3；以及(b)第二抗原结合域。

4、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)与抗体特异性地结合人类ox40的相同表位的第一抗原结合域，所述抗体包含vh和vl，所述vh包含氨基酸序列seq id no:54且所述vl包含氨基酸序列seq id no:55或56；以及(b)第二抗原结合域。

5、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域，其特异性地结合人类ox40且相较于与seq id no:72的人类ox40序列的结合，表达与seq id no:72相同但存在氨基酸突变的蛋白质的减少或缺少的结合，所述氨基酸突变选自由以下组成的群组：n60a、r62a、r80a、l88a、p93a、p99a、p115a和其的组合，其编号是根据seq id no:72；以及(b)第二抗原结合域。

6、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)包含vh和vl的特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域，其中所述vh包含氨基酸序列seq id no:54；以及(b)第二抗原结合域。

7、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)包含vh和vl的特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域，其中所述vl包含氨基酸序列seq id no:55或seq id no:56；以及(b)第二抗原结合域。

8、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域，包含：(i)包含氨基酸序列x1yx2mx3(seq id no:87)的vh-cdr1，其中x1为d、e或g；x2为a或v；且x3为y或h；(ii)包含氨基酸序列x1ix2tx3sgx4x5x6ynqkfx7x8(seq id no:88)的vh-cdr2，其中x1为v或l；x2为r、k或q；x3为y或f；x4为d、e或g；x5为v或l；x6为t或s；x7为k、r或q；且x8为d、e或g；(iii)包含氨基酸序列sgtvrgfay(seq id no:3)的vh-cdr3；(iv)包含氨基酸序列kssqsllnsx1nqknylx2(seq id no:90)的vl-cdr1，其中x1为g或s；且x2为t或s；(v)包含氨基酸序列wastres(seq id no:5)的vl-cdr2；以及(vi)包含氨基酸序列qnx1ysx2pyt(seq idno:92)的vl-cdr3，其中x1为d或e；且x2为y、f或s。

9、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)与抗体特异性地结合人类gitr的相同表位的第二抗原结合域，所述抗体包含vh和vl，所述vh包含氨基酸序列seq id no:18且所述vl包含氨基酸序列seq id no:19。

10、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)第二抗原结合域，其特异性地结合人类gitr的表位，所述表位包含seq id no:41的残基60至63中至少一个氨基酸。

11、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)第二抗原结合域，其特异性地结合以下每一者：i)包含seqid no:41的残基26至241的人类gitr以及ii)石蟹猕猴gitr的变异体，其包含seq id no:46的残基26至234，其中所述抗体不特异性地结合包含seq id no:44的残基26至234的石蟹猕猴gitr。

12、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)第二抗原结合域，其特异性地结合人类gitr且相较于与seq id no:41的残基26至241的人类gitr序列的结合，表达与seq id no:41的残基26至241相同但存在d60a或g63a氨基酸取代的蛋白质的减少或缺少的结合，其编号是根据seq idno:41。

13、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)第二抗原结合域，其特异性地结合人类gitr且包含vh和vl，其中所述vh包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:18、20、22、24和25。

14、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含：(a)第一抗原结合域；以及(b)第二抗原结合域，其特异性地结合人类gitr且包含vh和vl，其中所述vl包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:19、21、23和26。

15、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含第二抗原结合域。在一种情况下，所述第二抗原结合域特异性地结合tnfr超家族蛋白质。在一种情况下，所述tnfr超家族蛋白质选自由以下组成的群组：gitr、ox40(例如其中第二抗原结合域与第一抗原结合域结合不同的ox40表位)、cd137、dr3、cd40、baffr、cd27和hvem。

16、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的分离的多特异性(例如双特异性)抗体包含第一抗原结合域。在一种情况下，第一抗原结合域特异性地结合tnfr超家族蛋白质。在一种情况下，tnfr超家族蛋白质选自由以下组成的群组：gitr(例如其中第一抗原结合域与第二抗原结合域结合不同的gitr表位)、ox40、cd137、dr3、cd40、baffr、cd27和hvem。

17、在一种情况下，第二抗原结合域特异性地结合tnfr超家族蛋白质人类gitr。在一种情况下，结合人类gitr的第二抗原结合域包含：(i)包含氨基酸序列x1yx2mx3(seq id no:87)的vh-cdr1，其中x1为d、e或g；x2为a或v；且x3为y或h；(ii)包含氨基酸序列x1ix2tx3sgx4x5x6ynqkfx7x8(seq id no:88)的vh-cdr2，其中x1为v或l；x2为r、k或q；x3为y或f；x4为d、e或g；x5为v或l；x6为t或s；x7为k、r或q；且x8为d、e或g；(iii)包含氨基酸序列sgtvrgfay(seq id no:3)的vh-cdr3；(iv)包含氨基酸序列kssqsllnsx1nqknylx2(seq idno:90)的vl-cdr1，其中x1为g或s；且x2为t或s；(v)包含氨基酸序列wastres(seq id no:5)的vl-cdr2；以及(vi)包含氨基酸序列qnx1ysx2pyt(seq id no:92)的vl-cdr3，其中x1为d或e；且x2为y、f或s。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域与抗体结合人类gitr的相同表位，所述抗体包含vh和vl，所述vh包含氨基酸序列seq id no:18且所述vl包含氨基酸序列seq id no:19。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域结合人类gitr的表位，其包含seq id no:41的残基60至63中至少一个氨基酸。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域结合以下每一者：i)包含seq id no:41的残基26至241的人类gitr以及ii)石蟹猕猴gitr的变异体，其包含seq id no:46的残基26至234，其中所述第二抗原结合域不特异性地结合包含seq id no:44的残基26至234的石蟹猕猴gitr。在一种情况下，相较于与seq id no:41的残基26至241的人类gitr序列的结合，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域表达与seq id no:41的残基26至241相同但存在d60a或g63a氨基酸取代的蛋白质的减少或缺少的结合，其编号是根据seq id no:41。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh和vl，其中vh包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:18、20、22、24和25。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh和vl，其中vl包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:19、21、23和26。

18、在一种情况下，第一抗原结合域特异性地结合tnfr超家族蛋白质人类ox40。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含：(i)包含氨基酸序列gsamh(seqid no:47)的vh-cdr1；(ii)包含氨基酸序列rirskansyatayaasvkg(seq id no:48)的vh-cdr2；(iii)包含氨基酸序列giydssgydy(seq id no:49)的vh-cdr3；(iv)包含氨基酸序列rssqsllhsngynyld(seq id no:50)的vl-cdr1；(v)包含氨基酸序列lgsnras(seq id no:51)的vl-cdr2；以及(vi)包含氨基酸序列mqgskwplt(seq id no:52)或mqalqtplt(seq idno:53)的vl-cdr3。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域与抗体结合人类ox40的相同表位，所述抗体包含vh和vl，vh包含氨基酸序列seq id no:54且vl包含氨基酸序列seq id no:55或56。在一种情况下，相较于与seq id no:72的人类ox40序列的结合，所述特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域表达与seq id no:72相同但存在氨基酸突变的蛋白质的减少或缺少的结合，所述氨基酸突变选自由以下组成的群组：n60a、r62a、r80a、l88a、p93a、p99a、p115a的和其组合，其编号是根据seq id no:72。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh和vl，且vh包含氨基酸序列seq id no:54。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh和vl，且vl包含氨基酸序列seq id no:55或seq id no:56。

19、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含：(i)包含氨基酸序列x1yamx2(seq id no:1)的vh-cdr1，其中x1为d、g或e；且x2为y或h；(ii)包含氨基酸序列x1irtysgx2vx3ynqkfx4x5(seq id no:2)的vh-cdr2，其中x1为v或l；x2为d或g；x3为t或s；x4为k、r或q；且x5为d、e或g；(iii)包含氨基酸序列sgtvrgfay(seq id no:3)的vh-cdr3；(iv)包含氨基酸序列kssqsllnsx1nqknylt(seq id no:4)的vl-cdr1，其中x1为g或s；(v)包含氨基酸序列wastres(seq id no:5)的vl-cdr2；以及(vi)包含氨基酸序列qnx1ysx2pyt(seq idno:6)的vl-cdr3，其中x1为d或e；且x2为y或f。

20、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh-cdr1，选自由seq id no:7至9组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh-cdr2，包含选自由seq id no:10至13组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl-cdr1，包含氨基酸序列seq idno:14或15。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl-cdr3，包含氨基酸序列seq id no:16或17。

21、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3序列，其分别在seq id no:7、10和3；seq id no:8、11和3；seq id no:9、12和3；或seq id no:9、13和3中示出；和/或vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3序列，其分别在seq idno:14、5和16或seq id no:15、5和17中示出。

22、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含分别在seq id no:7、10、3、14、5和16中示出的vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3序列。

23、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh，vh包含在seqid no:25中示出的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh，vh包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列：seq id no:18、20、22和24。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh，vh包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:18、20、22和24。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh，vh包含氨基酸序列seq id no:18。

24、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含选自由seq id no:29至36组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含选自由seq id no:74至81组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seqid no:31。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:76。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:32。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:77。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:34。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:79。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq id no:35。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链，其包含氨基酸序列seq idno:80。

25、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh，包含源自于人类ighv1-2种系序列的氨基酸序列。

26、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl，vl包含氨基酸序列seq id no:26。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl，vl包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列：seq id no:19、21和23。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl，vl包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:19、21和23。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl，vl包含氨基酸序列seq id no:19。

27、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含轻链，其包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含轻链，其包含氨基酸序列seq id no:38。

28、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vl，其包含源自于人类igkv4-1种系序列的氨基酸序列。

29、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh和vl序列，其分别在seq id no:18和19、seq id no:20和21、seq id no:22和23或seq id no:24和23中示出。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含vh和vl，vh包含在seq idno:18中示出的序列且vl包含在seq id no:19中示出的序列。

30、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:31且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:76且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:32且轻链包含氨基酸序列seq idno:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:77且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:34且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:79且轻链包含氨基酸序列seq idno:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:35且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:80且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:29且轻链包含氨基酸序列seq idno:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:74且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:30且轻链包含氨基酸序列seq id no:37。在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:75且轻链包含氨基酸序列seq idno:37。

31、在一种情况下，特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区具有源自于人类ighv1-2种系序列的氨基酸序列且轻链可变区具有源自于人类igkv4-1种系序列的氨基酸序列。

32、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh，vh包含与氨基酸序列seq id no:54至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh，vh包含氨基酸序列seq id no:54。

33、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含选自由seq id no:59至66组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含选自由seq id no:118至125组成的群组的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:61。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:120。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:62。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:121。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:64。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:123。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:65。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链，重链包含氨基酸序列seq id no:124。

34、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh，vh包含源自于人类ighv3-73种系序列的氨基酸序列。

35、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl，vl包含与氨基酸序列seq id no:55或seq id no:56至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl-cdr3，vl-cdr3包含氨基酸序列seq id no:52。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl，vl包含氨基酸序列seq id no:55。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含轻链，轻链包含氨基酸序列seq id no:67。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含轻链，轻链包含氨基酸序列seq id no:68。

36、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl-cdr3，包含氨基酸序列seq id no:53。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl，包含氨基酸序列seq id no:56。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含轻链，轻链包含氨基酸序列seq id no:69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含轻链，轻链包含氨基酸序列seq id no:70。

37、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vl，包含源自于人类igkv2-28种系序列的氨基酸序列。

38、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含分别在seq id no:54和55或seq id no:54和56中示出的vh和vl序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:59且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:118且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:64且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:123且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:65且轻链包含氨基酸序列seqid no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:124且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seqid no:61且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:120且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:62且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含重链和轻链，重链包含氨基酸序列seq id no:121且轻链包含氨基酸序列seq id no:67或69。

39、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含vh和vl，vh包含源自于人类ighv3-73种系序列的氨基酸序列且vl包含源自于人类igkv2-28种系序列的氨基酸序列。

40、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:54中示出的vh序列和在seq id no:55或56中示出的vl序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:18中示出的vh序列和在seq id no:19中示出的vl序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:59中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:29中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:118中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且其中特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:74中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:61中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:31中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:120中示出的重链序列和在seqid no:67或69中示出的轻链序列，且其中特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:76中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:62中示出的重链序列和在seqid no:67或69中示出的轻链序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seqid no:32中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:121中示出的重链序列和在seq idno:67或69中示出的轻链序列，且其中特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seqid no:77中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:64中示出的重链序列和在seq idno:67或69中示出的轻链序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq idno:34中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:123中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且其中特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq idno:79中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:65中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:35中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:124中示出的重链序列和在seq id no:67或69中示出的轻链序列，且其中特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含在seq id no:80中示出的重链序列和在seq id no:37中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:67中示出的轻链序列。在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含在seq id no:69中示出的轻链序列。

41、在一种情况下，特异性地结合人类ox40的第一抗原结合域包含源自于人类ighv3-73种系序列的vh和源自于人类igkv2-28种系序列的vl，且特异性地结合人类gitr的第二抗原结合域包含源自于人类ighv1-2种系序列的vh和源自于人类igkv4-1种系序列的vl。

42、在一种情况下，抗体为κ-λ体、双亲和重靶向分子(dart)、杵入臼型抗体、股交换工程改造结构域体(seed体)或双特异性抗体抗体(genmab a/s)。

43、在一种情况下，第一抗原结合域包含选自由以下组成的群组的重链恒定区：人类igg1、人类igg2、人类igg3、人类igg4、人类iga1和人类iga2，且第二抗原结合域包含选自由以下组成的群组的重链恒定区：人类igg1、人类igg2、人类igg3、人类igg4、人类iga1和人类iga2。在一种情况下，第一抗原结合域的重链恒定区为人类igg1，且第二抗原结合域的重链恒定区为人类igg1。

44、在一种情况下，(a)第一抗原结合域包含第一重链恒定区，第一重链恒定区包含f405l氨基酸突变；且(b)第二抗原结合域包含第二重链恒定区，第二重链恒定区包含k409r氨基酸突变，其编号是根据eu编号系统。在一种情况下，(a)第一抗原结合域包含第一重链恒定区，第一重链恒定区包含k409r氨基酸突变；且(b)第二抗原结合域包含第二重链恒定区，第二重链恒定区包含f405l氨基酸突变，其编号是根据eu编号系统。在一种情况下，第一抗原结合域的重链恒定区为igg1。在一种情况下，第二抗原结合域的重链恒定区为igg1。

45、在一种情况下，第一抗原结合域包含选自由人类iggκ和iggλ组成的群组的轻链恒定区，且第二抗原结合域包含选自由人类iggκ和iggλ组成的群组的轻链恒定区。

46、在一种情况下，相较于与seq id no:41的残基26至241的人类gitr序列的结合，第二抗原结合域表达与seq id no:41的残基26至241相同但存在d60a氨基酸取代的蛋白质的减少或缺少的结合，其编号是根据seq id no:41。在一种情况下，相较于与seq id no:41的残基26至241的人类gitr序列的结合，第二抗原结合域表达与seq id no:41的残基26至241相同但存在g63a氨基酸取代的蛋白质的减少或缺少的结合，其编号是根据seq id no:41。在一种情况下，结合人类gitr的第二抗原结合域结合选自由seq id no:41的残基60、62和63组成的群组的至少一个残基。在一种情况下，结合人类gitr的第二抗原结合域结合选自由seq id no:41的残基62和63组成的群组的至少一个残基。在一种情况下，结合人类gitr的第二抗原结合域结合选自由seq id no:41的残基60和63组成的群组的至少一个残基。在一种情况下，结合人类gitr的第二抗原结合域结合包含seq id no:41的残基60至63的表位。

47、在一种情况下，抗体(i)相较于结合人类gitr且与结合人类gitr的第二抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，显示与表达人类gitr和人类ox40的细胞增加的结合；和/或(ii)相较于结合人类ox40且与结合人类ox40的第一抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，显示与表达人类gitr和人类ox40的细胞增加的结合。

48、在一种情况下，抗体(i)相较于结合人类gitr且与结合人类gitr的第二抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，显示与gitr阳性、ox40阴性细胞减少的结合；和/或(ii)相较于结合人类ox40且与结合人类ox40的第一抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，显示与gitr阴性、ox40阳性细胞减少的结合。

49、在一种情况下，抗体(i)相较于结合人类gitr且与结合人类gitr的第二抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，诱导对调节性t细胞更强的自然杀手细胞介导的细胞毒性；和/或(ii)相较于结合人类ox40且与结合人类ox40的第一抗原结合域含有相同的vh和vl的单特异性二价抗体，诱导对调节性t细胞更强的自然杀手细胞介导的细胞毒性。

50、在一种情况下，抗体抑制人类gitr配体与人类gitr结合。在一种情况下，抗体抑制人类ox40配体与人类ox40结合。

51、在一种情况下，抗体当结合经活化的调节性t细胞时与选自由cd16、cd32a和cd64组成的群组的活化性fcγ受体的结合程度大于抗体当结合经活化的效应t细胞时与选自由cd16、cd32a和cd64组成的群组的活化性fcγ受体的结合程度。在一种情况下，活化性fcγ受体表达于选自由骨髓衍生的效应细胞和淋巴球衍生的效应细胞组成的群组的细胞上。

52、在一种情况下，抗体对人类gitr和/或人类ox40具有促效性。在一种情况下，抗体诱导、活化或增强人类gitr的活性。在一种情况下，抗体诱导、活化或增强人类ox40的活性。

53、在一种情况下，第一抗原结合域包含人类igg1重链恒定区，人类igg1重链恒定区包含n297a突变或n297q突变和/或第二抗原结合域包含人类igg1重链恒定区，包含n297a突变或n297q突变，其编号是根据eu编号系统。

54、在一种情况下，抗体对人类gitr和/或人类ox40具有拮抗性。在一种情况下，抗体去活化、降低或抑制人类gitr的活性。在一种情况下，抗体去活化、降低或抑制人类ox40的活性。在一种情况下，抗体抑制或减少人类gitr信号传导。在一种情况下，抗体抑制或减少人类ox40信号传导。在一种情况下，抗体抑制或减少由人类gitr配体诱导的人类gitr信号传导。在一种情况下，抗体抑制或减少由人类ox40配体诱导的人类ox40信号传导。

55、在一种情况下，抗体减少由来自类风湿性关节炎患者的滑液诱导的cd4+t细胞增殖。在一种情况下，抗体增加接受人类pbmc移植的nog小鼠的存活率。在一种情况下，抗体增加gvhd模型中调节性t细胞的增殖。

56、在一种情况下，抗体进一步包含可侦测的标记。

57、本发明亦提供组合物。在一种情况下，组合物包含(i)编码本发明提供的抗体的第一抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子；(ii)编码本发明提供的抗体的第一抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子；(iii)编码本发明提供的抗体的第二抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子；以及(iv)编码本发明提供的抗体的第二抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子。

58、本发明亦提供宿主细胞。在一种情况下，宿主细胞包含(i)编码本发明提供的抗体的第一抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子；(ii)编码本发明提供的抗体的第一抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子；(iii)编码本发明提供的抗体的第二抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子；以及(iv)编码本发明提供的抗体的第二抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子。在一种情况下，宿主细胞是选自由以下组成的群组：大肠杆菌、假单孢菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)、酵母菌、cho、yb/20、ns0、per-c6、hek-293t、nih-3t3、hela、bhk、hep g2、sp2/0、r1.1、b-w、l-m、cos 1、cos 7、bsc1、bsc40、bmt10细胞、植物细胞、昆虫细胞和组织培养的人类细胞。本发明亦提供制备结合gitr和/或ox40的多特异性(例如双特异性)抗体的方法。在一种情况下，方法包括培养本发明提供的宿主细胞以使核酸分子表达且产生抗体。

59、本发明亦提供使用与gitr和/或ox40结合的多特异性(例如双特异性)抗体的方法。在一种情况下，在样品中侦测表达gitr和ox40的细胞的方法包括使样品与本发明提供的抗体接触。

60、本发明亦提供医药组合物。在一种情况下，医药组合物包含本发明提供的抗体和医药学上可接受的赋形剂。

61、本发明亦提供试剂盒。在一种情况下，试剂盒包含本发明提供的抗体或医药组合物以及a)侦测试剂、b)gitr和/或ox40抗原、c)反映批准用于人类投药的使用或销售的注记或d)其组合。

62、本发明亦提供使用本发明提供的抗体和医药组合物的方法。在一种情况下，调节个体的免疫反应的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。在一种情况下，用于增强或诱导个体的免疫反应的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。

63、在一种情况下，治疗个体的癌症的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。在一种情况下，癌症选自由黑素瘤、肾癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌组成的群组。在一种情况下，方法进一步包含对个体投予吲哚胺-2,3-二氧化酶(ido)的抑制剂。在一种情况下，抑制剂为埃帕多塔(epacadostat)。在一种情况下，抑制剂为f001287。在一种情况下，抑制剂为吲哚西莫(indoximod)。在一种情况下，抑制剂为nlg919。在一种情况下，方法进一步包含对个体投予疫苗。在一种情况下，疫苗包含热休克蛋白肽复合物(hsppc)，hsppc包含与抗原肽复合的热休克蛋白。在一种情况下，热休克蛋白为hsp70或hsc70且与肿瘤相关抗原肽复合。在一种情况下，热休克蛋白为gp96蛋白且与肿瘤相关抗原肽复合，其中hsppc源自于自个体获得的肿瘤。在一种情况下，方法进一步包含对个体投予检查点靶向剂。在一种情况下，检查点靶向剂选自由以下组成的群组：拮抗剂抗pd-1抗体、拮抗剂抗pd-l1抗体、拮抗剂抗pd-l2抗体、拮抗剂抗ctla-4抗体、拮抗剂抗tim-3抗体、拮抗剂抗lag-3抗体、拮抗剂抗ceacam1抗体、促效剂抗gitr抗体和促效剂抗ox40抗体。

64、在一种情况下，治疗感染性疾病的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。

65、在一种情况下，减少或抑制个体的免疫反应的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。

66、在一种情况下，治疗个体的自体免疫性或发炎性疾病或病症的方法包含对个体投予有效量的本发明提供的抗体或医药组合物。在一种情况下，自体免疫性或发炎性疾病或病症是选自由以下组成的群组：移植排斥反应、移植物抗宿主病、血管炎、气喘、类风湿性关节炎、皮炎、发炎性肠病、葡萄膜炎、狼疮、结肠炎、糖尿病、多发性硬化和气管发炎。

67、在一种情况下，个体为人类。