一种基于数字PCR技术的5种病毒联合检测试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种基于数字pcr技术的病毒联合检测试剂盒。

背景技术：

1、h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒均为动物源人兽共患病，目前无同时检测上述病原体的荧光探针pcr技术。

技术实现思路

1、本发明基于荧光探针法，针对靶基因设计特异性引物探针，检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒这5种病毒基因。

2、本发明公开了一种用于检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒的核酸组合，其特征在于：

3、检测h7n9的探针序列h7n9-p为5’-r1-ccccggatgtgctc-q1-3’；

4、检测狂犬病毒的探针序列rv-p为5’-r2-ctgacgatgtatgttcc-q2-3’；

5、检测尼帕病毒的探针序列nip-p为5’-r3-caccctggtctctg-q3-3’，

6、检测流行性乙脑的探针序列je-p为5’-r4-tggactgaaaactgaagc-q4-3’，

7、检测汉坦病毒的探针序列hant-p为5’-r5-cggaaaccaaaacat-q5-3’；

8、内参探针ic-p序列为5’-r6-agtttgcgacatctc-q6-3’；

9、所述的r1-r6为荧光报告基团，q1-q6为荧光淬灭基团。

10、优选地，r1-r6选自fam、vic、rox、cy5、a425或cy5.5；q1-q6选自mgb、bhq1 或bhq2。

11、相应的核酸探针的引物和内参探针的引物为：

12、h7n9-f：ctcgtgcgtactggaatgga，h7n9-r：cgggagagttgatccttgca；

13、rv-f：gcgccgccaaacttgat，rv-r：ttgccgccgccaaat；

14、nip-f：acggcctacggataacagaca，nip-r：tgggcctcgatggtgataac；

15、je-f：gctggactgtgagccaagga，je-r：ccccacggtcatgacgtaa；

16、hant-f：tcgttcgaggatgttaacggtat，hant-r：gcatttggcaaggacacgta；

17、ic-f：cagcgtgaagcgcttttca，ic-r：aaccacactgcgccaagag。

18、本发明还公开了包括上述核酸组合(引物和探针)的试剂盒。

19、上述的试剂盒在检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒中的用途。

20、本发明公开了一种检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒的方法，其特征在于，使用如权利要求1-3所述核酸组合对样本进行数字pcr检测。

21、根据上述的方法，优选地，每种引物的用量为100-300um,每种探针的用量为100-300 um。

22、根据上述的方法，优选地，所述数字pcr的扩增条件为：98℃预变性5min；循环内98℃变性15s、60℃复性1min，40个循环。

23、与现有技术相比，本发明有如下优势：

24、多重数字pcr体系解决同时检测一例样本中是否含h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒

25、可检测到终浓度为100iu/ml的病毒核酸，灵敏度高。

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技术特征：

1.一种用于检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒的核酸组合，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，r1-r6选自fam、vic、rox、cy5、a425或cy5.5；q1-q6选自mgb、bhq1或bhq2。

3.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，相应的核酸探针的引物和内参探针的引物为：

4.一种试剂盒，包括如权利要求1-3所述的核酸组合。

5.如权利要求4所述的试剂盒在检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒中的用途。

6.一种检测h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒的方法，其特征在于，使用如权利要求1-3所述核酸组合对样本进行数字pcr检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每种引物的用量为100-300um,每种探针的用量为100-300um。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述数字pcr的扩增条件为：98℃预变性5min；循环内98℃变性15s、60℃复性1min，40个循环。

技术总结
本发明提供了一种基于数字PCR技术的病毒联合检测试剂盒。本发明的原理是基于荧光探针法，针对靶基因设计特异性引物探针，检测5种病毒基因。本发明利用多重数字PCR体系解决同时检测一例样本中是否含H7N9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒可检测到终浓度为100IU/mL的病毒核酸，灵敏度高。

技术研发人员：夏江,位玉玲
受保护的技术使用者：领航基因科技（杭州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12