一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用的制作方法

一种用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组、试剂、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组、试剂、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.梅毒是由梅毒螺旋体(treponema pallidum，tp)引起的慢性、系统性传播疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》中的乙类防止管理病种。其病程复杂，临床上表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒等。早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，可通过性行为传播，母婴传播，危害性极大。梅毒的防止主要在于早发现、早诊断和早治疗，其诊断仍主要根据临床表现、镜检出病原体和血清学检测为主。梅毒感染是全球性的公共卫生问题，近年来随着科技发展，对梅毒的准确及时检测也在不断改进简化。
3.近年来，随着分子生物学技术的发展，快速、灵敏和特异性高的梅毒诊断方法得到了不断的更新完善。梅毒螺旋体的基因序列已测序完成，因此基于梅毒dna建立分子生物学检测方法如聚合酶链式反应(pcr)和荧光定量pcr(fluorescence quantitative pcr)可以克服血清学检测的缺点。但传统基于pcr的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。
4.rpa技术(重组酶聚合物扩增技术)是一项新型的等温扩增技术，被称为可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，其主要原理是重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。
5.因此，开发出一种用于梅毒螺旋体rpa引物对于梅毒螺旋体的检测具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组、试剂、试剂盒及其应用。
7.本发明的技术内容如下：
8.本发明提供了一种用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组，其核苷酸序列如序列表seq id no.1和seq id no.2所示；
9.上游引物seq id no.1：5
’‑
acacaggttgcagagcagacacgtaaaaccggc-3’；
10.下游引物seq id no.2：5
’‑
ctgcagcaacaattgtgcacgtaacggtcggcg-3’；
11.所述上游引物的5’端采用fam进行标记；
12.所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。
13.本发明还提供了一种用于检测梅毒螺旋体的rpa试剂，所述rpa试剂包括上述rpa引物组；
14.所述rpa试剂中，rpa引物组中的上游引物和下游引物的浓度为10～20μmol/l。
15.本发明还提供了一种用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括上述rpa引物组、rpa试剂以及侧向流试纸条。
16.本发明还提供了上述引物或上述试剂在制备梅毒螺旋体及其产品的检测产品的应用。
17.本发明还提供了上述试剂盒在梅毒螺旋体及其产品检测中的应用。
18.本发明还提供了一种用于梅毒螺旋体的rpa检测方法，包括如下步骤：
19.1)将上述rpa引物对待测病毒进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；
20.所述rpa扩增的模板为待测病毒的dna；
21.2)将rpa扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为梅毒螺旋体，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为梅毒螺旋体；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含梅毒螺旋体；
22.所述rpa扩增的温度37℃，扩增时间为20～60min。
23.本发明的有益效果如下：
24.本发明的用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组，为针对梅毒螺旋体的dna序列设计得到，用于对梅毒螺旋体的定性检测，所述rpa引物组具有特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊仪器、适用范围广，最低能检测拷贝数为100copies/μl的梅毒螺旋体dna，具体有如下优点：仅需一对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需20-60min；结果易于判断；检测灵敏度高，可检测到血液样本中提取的梅毒螺旋体dna。本发明基于rpa的检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义；
25.本发明的用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，采用rpa引物或试剂，以及试纸条，本发明的方法，能够特异地检测梅毒螺旋体，且与其他病原体无交叉反应。与现有检测梅毒螺旋体的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案有如下优点：首先，与传统的pcr或其他分子检测技术相比，本发明提供的重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法，能够在恒温条件下进行(个人体温亦可完成检测反应)，不需要较昂贵的pcr仪等热循环设备，不受实验空间的限制；其次，本发明提供的检测方法在恒温条件下实现对梅毒螺旋体核酸的快速、特异的扩增，整个检测流程，从样本核酸提取到结果判读能在30min内完成，具有良好的操作性，远快于pcr技术或其他等温扩增方法。
附图说明
26.图1为cev的raa检测引物筛选的凝胶结果图(m：分子量marker；1：第一组引物扩增结果；2：第二组引物扩增结果)；
27.图2为本发明中用于检测和/或辅助检测梅毒螺旋体的引物组特异性检测结果图(ct衣原体；gc：淋球菌；gbs:b族链球菌；mp：支原体；tp：梅毒螺旋体)；
28.图3为图2为rpa-lfd法对trp的灵敏度实验图。
具体实施方式
29.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
30.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
31.本发明实施例所采用的梅毒螺旋体dna来源为血液样本，为中国科学院大学深圳医院(光明)提供。
32.本发明实施例rpa扩增反应为采用英国twistdx inc公司的twistbasic试剂盒，以及采用milenia公司的hybridetect 1lateral flow strips侧向层析试纸检测结果。
33.实施例1
34.一种用于检测梅毒螺旋体的rpa引物组
35.针对梅毒螺旋体的保守序列，设计检测梅毒螺旋体的rpa引物组，产物大小为231bp；针对引物组和扩增片段设计阳性对照样品为含有阳性对照的dna质粒。
36.所述引物组和阳性对照样品中含有的阳性对照质粒的序列如表1所示：
37.表1引物组和阳性对照质粒的序列
[0038][0039]
实施例2
[0040]
一种用于检测梅毒螺旋体的rpa试剂盒
[0041]
所述试剂盒包括实施例1所述的rpa-上游引物f(10～20μm)、rpa-下游引物r(10～20μm)、阳性对照质粒、水化缓冲液、醋酸镁(280mm)、模板dna及无核酸酶纯水；
[0042]
所述水化缓冲液、醋酸镁(280mm)、模板dna及无核酸酶纯水均来源于rpa扩增试剂盒twistamp basic kits；
[0043]
所述侧向层析试纸条及分析溶液均来源于hybridetect 1lateral flow strips侧向层析试纸产品。
[0044]
实施例3
[0045]
一种用于检测梅毒螺旋体的检测方法
[0046]
1)以待测样品的dna为模板，采用rpa引物进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；
[0047]
所述rpa扩增的体系的配制为：将水化缓冲液29.5μl，醋酸镁(初始浓度为280mm)2.5μl，18μl的引物、模板dna和无核酸酶纯水进行混合，其中，上游引物和下游引物(终浓度为0.48μmol/l))各2μl，模板dna 2μl，无核酸酶纯水12μl；rpa扩增反应条件：先将上述rpa扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到rpa扩增产物；
[0048]
2)取20μl扩增产物，与80μl分析溶液混匀后滴加于试纸条加样区，室温孵育5min，观察条带。
[0049]
对比例1
[0050]
设置阳性对照组，将实施例3步骤1)中的rpa引物替换成阳性对照质粒，其他同步骤不变。
[0051]
对比例2
[0052]
设置阴性对照组，将实施例3步骤1)中的dna模板替换成超纯水，其他同步骤不变。
[0053]
试纸条的检测判定规则如图1所示，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为梅毒螺旋体；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有梅毒螺旋体。
[0054]
1.特异性检测
[0055]
实施例3、对比例1以及对比例2的试纸条结果如图2所示，阳性对照及梅毒螺旋体扩增后产物滴加在试纸条上，有两条清晰条带，而阴性对照只有一条质控带。
[0056]
2.灵敏度检测
[0057]
标准质粒的制备：以梅毒螺旋体dna为模板，利用实施例1合成的用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物为引物，进行pcr反应，扩增目的基因。其中，pcr反应体系为50μl：10
×
buffer(含mg2+)5μl、dntp(10mm)1μl、上下游引物(25μm)各1μl、taqtm聚合酶(5u
·
μl-1)0.5μl、模板dna(5ng/μl)2μl，ddh2o补足50μl。pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。pcr扩增产物用琼脂糖电泳检测，胶回收目的基因条带，将目的基因克隆到puc57载体上，得到含有目的基因的质粒，以含有目的基因的质粒做为标准质粒；利用紫外分光光度计测定标准质粒在od260nm的吸光度值，按照公式核酸浓度＝od260吸光度值
×
50μg/ml计算标准质粒的核酸浓度，然后按照公式(6.02
×
10
23
拷贝数/摩尔)
×
(核酸浓度ng/μl
×
10-9)/(核酸长度
×
660)＝标准质粒拷贝数copies/μl计算出标准质粒拷贝数。
[0058]
将上述标准质粒进行10倍连续倍比稀释，得到浓度分别为10
4-100copies/μl的标准质粒稀释液，以稀释后的不同浓度的标准质粒稀释液为模板进行rpa扩增反应，来确定引物的灵敏度。所述rpa扩增反应体系、加样顺序和反应条件同实施例3中最后优化得到的条件，扩增产物用胶体金侧向流免疫层析试纸条检测的检测方法同实施例3。结果如图3所示，本发明所设计的引物以及所建立检测方法最低能检测拷贝数为100copies/μl的梅毒螺旋体dna，具有较优灵敏度。