一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

本发明属于生物检测，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒h蛋白胞外区(以下简称th)单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy及应用；本发明利用原核表达并纯化的重组 th蛋白为检测抗原，以杂交瘤细胞株10-1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体为竞争抗体，建立celisa方法，并优化形成了celisa试剂盒。

背景技术：

1、小反刍兽疫(peste des petits ruminants，ppr)是由小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus，pprv)引起的一种急性、烈性、接触性a类传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，主要表现为发热、腹泻、肠炎、肺炎等临床症状，发病率和致死率均非常高，为一种重大跨国传播的动物疫病。因此，我们必须加强对ppr的研究工作，特别是诊断制剂。

2、h蛋白是pprv的一种重要的跨膜糖蛋白，含有609个氨基酸，估计分子质量为70kd；构成病毒粒子表面的纤突，具有神经氨酸酶和血凝素的功能，且含有t细胞决定簇，是几种结构蛋白中最易变异的蛋白。h蛋白的主要作用是与宿主细胞膜受体发生结合，调节病毒吸附并侵入宿主细胞，并刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫，是病毒的主要抗原成份，也是引起宿主细胞病变(cpe)的决定因素。近年来，国内外学者利用多种表达体系对pprv h蛋白的表达进行了研究。stech等在哺乳动物细胞中表达的重组h糖蛋白具有生物活性。 balamurugan利用vero细胞系表达h糖蛋白，并评估了其作为酶联免疫吸附反应诊断抗原的潜力。diallo等把pprv的f基因和h基因引进山羊痘病毒疫苗株的基因组中，产生的重组病毒可以有效的防止pprv和山羊痘病毒的感染。此外，还有研究发现去除胞内区的截短h蛋白(truncated h protein)仍具有正常的与细胞受体结合的能力。

3、除了传统的临床诊断方法，目前已经研究出多种针对pprv抗体的诊断技术，这些方法包括病毒中和试验(vn)、琼脂扩散(agid)、免疫荧光抗体试验(ifat)和对流免疫电泳(ciep)等。随着免疫学和分子生物学的在动物疫病诊断中的应用和发展，目前已有pcr、酶联免疫吸附试验(elisa)和其它分子生物学检测方法等多种ppr检测方法，其中间接竞争elisa(celisa)和pcr方法是oie推荐的检测方法。由于感染pprv的动物血清抗体有相当一部分是针对n蛋白和h蛋白的，因此已经研制出许多针对pprv和rpv n、h蛋白的竞争elisa试验方法，并且该方法已成为oie的标准检测方法之一。libeau应用重组杆状病毒表达的n蛋白建立了检测pprv抗体的celisa方法，单抗和待检血清抗体竞争性地结合抗原，提高了试验的特异性。saliki等建立了针对pprv h蛋白的阻断elisa(b-elisa) 方法，与竞争elisa原理基本一致，都是两种抗体竞争结合同一抗原表位。但是在celisa 方法中，样品和单抗同时与抗原结合，而b-elisa是先将样品和抗原反应，然后再加入检测单抗，所用的时间要比celisa方法长。2004年，singh等制备了一株针对pprv h蛋白中和表位的单克隆抗体，建立了竞争elisa的检测方法。与vnt相比，更加方便快捷；但也存在一些缺点，如不能区分rpv与prrv。其后韩国科学家choi等又研发出了一种检测ppr 的快速竞争elisa(rapidcelisa)，该方法是在包被了pprv重组核衣壳蛋白(rpprv-n) 的反应孔中，将血清与单抗混合孵育30min，然后对单抗进行定量。对249个pprv阳性血清和733个阴性血清样品进行检测，用该方法检测免疫了rpv的高免血清，vnt≥1:512时，检测结果呈阳性，但显示的抗体滴度只有1:2～1:16；vnt≤1:128，则检测结果呈阴性，说明该方法能较好的区分pprv与rpv感染。通过对琼脂糖凝胶免疫电泳方法(agid)和celisa 两种血清学方法进行比对，发现celisa的特异性和敏感性高于agid的，agid法可将 celisa阳性样品检测为阴性。

4、综上所述，研发出具有快速、特异、敏感的中和抗体诊断试剂盒，具有及其重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒th单克隆抗体的杂交瘤细胞株；并构建一种具备良好稳定性、特异性、准确性和高亲和力的小反刍兽疫病毒中和抗体celisa试剂盒及其使用方法。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy，所述的杂交瘤细胞株10-1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:cgmcc no.17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010-64807355。

3、第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy在生产抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体中的应用。

4、第三方面，本发明提供了一种抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体，所述抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体由上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy或其传代细胞株分泌产生。

5、第四方面，本发明提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy，和/或上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体在制备用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的检测试剂、试剂盒或试纸条中的应用。

6、优选地，所述试剂盒为间接竞争elisa试剂盒。

7、第五方面，本发明提供了一种用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的间接竞争elisa试剂盒，所述试剂盒包括单克隆抗体、包被抗原、包被液、酶标板、标准血清、血清稀释液、酶标二抗、封闭液、显色液、终止液和洗涤液；所述单克隆抗体为上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒th单克隆抗体。

8、优选地，所述包被抗原为重组小反刍兽疫病毒th蛋白。

9、优选地，所述包被液为0.05mol/l碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph9.6。

10、优选地，所述洗涤液为1×pbst。

11、优选地，所述封闭液为1％bsa。

12、优选地，所述终止液为1mol/l h2so4溶液。

13、优选地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠igg。

14、第六方面，本发明提供了一种非疾病诊断和治疗目的的小反刍兽疫间接竞争elisa检测方法，所述方法包括如下步骤：

15、(1)包被酶标板：用包被液稀释纯化后的包被抗原包被酶标板，封板膜封板，反应；

16、(2)封闭酶标板：洗涤步骤(1)处理后的酶标板，加入封闭液，封板膜封板，反应；

17、(3)加入血清和抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体：洗涤步骤(2)处理后的酶标板，将酶标板孔分为阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔和空白对照孔；其中阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔中分别加入等量的阳性血清、阴性血清、待检血清、血清稀释液，后再加入等量的单克隆抗体和酶结合物工作液混合均匀；空白对照孔加入与阳性对照孔中液体总量一致的血清稀释液；封板膜封板反应；所述单克隆抗体工作液为血清稀释液稀释的单克隆抗体；

18、(4)加入酶标二抗：洗涤步骤(3)处理后的酶标板，每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠igg酶结合物工作液，封板膜封板，反应；

19、(5)显色：取步骤(4)处理后的酶标板，每孔加入等量的底物溶液，避光反应；

20、(6)终止：取步骤(5)处理后的酶标板，每孔加入等量的1m硫酸，在酶标仪上读取od450的光吸收值；

21、(7)结果判定：根据公式计算各样品抑制率(pi)值，pi＝(1－(样品孔的od450/单抗对照孔的od450))×100％；其中，pi＞50％，抗体阳性；pi＜50％，抗体阴性；pi＝50％，判定阳性可疑，重复检测一次，结果≥50％，为抗体阳性；＜50％需再次检测。

22、优选地，所述包被抗原的包被量为0.05μg/孔。

23、优选地，所述步骤(1)为：用包被液稀释纯化的重组蛋白th蛋白，包被酶标板，封板膜封板，于37℃包被2h或4℃包被过夜；

24、优选地，所述步骤(2)为：用1×pbst洗涤步骤(1)处理后的酶标板3次，每孔加入1％bsa封闭液100μl，封板，于37℃反应1h；

25、优选地，所述步骤(3)为：1×pbst洗涤步骤(2)处理后的酶标板3次，将酶标板孔分为阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔和空白对照孔；其中阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔中分别加入50μl/孔的阳性血清、阴性血清、待检血清、血清稀释液，后再加入50μl/孔的单克隆抗体工作液，混合均匀；空白对照孔加入100μl/ 孔的血清稀释液；封板膜封板，37℃反应1h；

26、优选地，所述单克隆抗体工作液为单克隆抗体与血清稀释液1:8000稀释。

27、优选地，所述步骤(4)为：1×pbst洗涤步骤(3)处理后的酶标板3次，每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠igg酶结合物工作液50μl；封板膜封板，37℃反应1h；

28、优选地，所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠igg酶结合物工作液为：辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠igg与血清稀释液1:6000稀释。

29、优选地，所述步骤(5)为：取步骤(4)处理后的酶标板，每孔加入底物溶液50μl，封板，37℃避光反应10min；

30、优选地，所述步骤(6)为：取步骤(5)处理后的酶标板，每孔加入1m硫酸50μl终止反应。

31、本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy，所述的杂交瘤细胞株10-1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:cgmcc no.17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010-64807355； (2)所述杂交瘤细胞株10-1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒h蛋白胞外区单克隆抗体亚型为 igg3，轻链类型为κ，间接elisa检测方法测定其腹水效价为6.4×104，且具有耐热、耐酸、耐碱性能，稳定性好、亲和力高的特点，因此可用作竞争性抗体检测抗小反刍兽疫病毒h蛋白的中和抗体；(3)本发明根据间接竞争elisa反应原理，参照商品化celisa试剂盒，以上述制备的抗小反刍兽疫病毒th蛋白单克隆抗体作为竞争抗体，建立了检测抗小反刍兽疫病毒h蛋白中和抗体的celisa方法，所建立的celisa方法反应特异性好、敏感性高，与商品化celisa试剂盒的符合率高(97.7％)，操作简单、成本低廉、反应结果稳定可靠，为我国及世界防控乃至消除ppr疫情提供了新的技术支持。