一种提高精子细胞DNA提取浓度的试剂及试剂盒的制作方法

一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及dna检测技术领域，具体为一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂及试剂盒。


背景技术：

2.精子dna检测在医学和刑侦领域是判定身份的和疾病诊断的重要手段，但是在现实中，人体精子量有限，造成精子dna提取的量有限，特别是在刑侦领域，痕量的精子中提取dna是困难的。
3.成熟精子细胞的dna被鱼精蛋白包裹，鱼精蛋白即精核蛋白，是一种富含精氨酸和半胱氨酸的碱性蛋白质，因此利用常规提取血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒提取精子细胞dna时，细胞裂解不充分，比如天根生化科技有限公司的产品，货号：dp304，很难获得高浓度，高纯度的精子dna，造成精子细胞dna检测难度较大。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂及试剂盒，解决了精子细胞高浓度dna提取难度大的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，dna提取试剂具体包括蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、超顺磁珠、洗涤剂和洗脱液；
8.所述蛋白酶抑制剂为苯甲酰磺酰氟和n-(反式-环氧丁二酰基)-l-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(e64)的共混物；
9.所述细胞裂解液为非离子性聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇和二硫苏糖醇的共混物；
10.所述超顺磁珠包括磁性二氧化硅纳米粒子、异硫氰酸胍和外部磁场；
11.所述洗涤剂为碳酸氢钠，且碳酸氢钠内添加胎牛血清；
12.所述洗脱液为70％的乙醇。
13.优选的，所述二硫苏糖醇的摩尔浓度为1mol/l。
14.一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂盒，包括权利要求1或2所述的dna提取试剂。
15.优选的，所述胎牛血清通过无菌处理，且在使用前需要对胎牛血清进行常规病毒检测。
16.优选的，所述试剂盒的具体使用方法如下：
17.步骤一.首先将待检测的新鲜精子倒入试剂盒的试管内，向试管内滴加蛋白酶抑制剂，摇晃混合均匀，静置5-7分钟，再向试管内倒入细胞裂解液，摇晃均匀，静置20-25分
钟，得到裂解细胞液；
18.步骤二.再向试管内加入磁性二氧化硅纳米粒子，摇晃试管，使得磁性二氧化硅纳米粒子与试管内裂解的细胞液充分混合，再向试管内滴加异硫氰酸胍，摇晃试管，使得异硫氰酸胍均匀分布在试管内。
19.步骤三.向试管内滴加洗涤剂，摇晃试管，使得洗涤剂均匀分布在试管内，再将外部磁场施加在试管外侧；
20.步骤四.再向试管内滴加洗脱液，在施加外部磁场的情况下将试管静置30-40分钟即可得到纯化的精子细胞dna。
21.优选的，精子细胞在离体一个小时内需要进行检测，若不能及时检测，精子细胞离体后的保存温度为-20摄氏度。
22.优选的，每3ml精子细胞内加入蛋白酶抑制剂200-300ul、细胞裂解液200-300ul、磁性二氧化硅纳米粒子0.02-0.05ug、异硫氰酸胍50-80ul、洗涤剂100-200ul，洗脱剂100-200ul。
23.优选的，所述碳酸氢钠和胎牛血清的比例为5:1。
24.(三)有益效果
25.本发明提供了一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂及试剂盒。具备以下有益效果：
26.本发明通过在细胞裂解液中添加二硫苏糖醇，并采用超顺磁珠引导的方式，使得细胞裂解充分，使得精子细胞内的dna被充分的提取出来，使得有限的精子细胞内的dna可以最大限度的被提取，大大提高了dna的浓度和纯度，使得刑侦领域和医学领域的精子dna检测不受精子量的影响。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例一：
29.本发明实施例提供一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，dna提取试剂具体包括蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、超顺磁珠、洗涤剂和洗脱液；
30.蛋白酶抑制剂为苯甲酰磺酰氟和n-(反式-环氧丁二酰基)-l-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(e64)的共混物；
31.细胞裂解液为非离子性聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇和二硫苏糖醇的共混物，二硫苏糖醇的摩尔浓度为1mol/l；
32.超顺磁珠包括磁性二氧化硅纳米粒子、异硫氰酸胍和外部磁场；
33.洗涤剂为碳酸氢钠，且碳酸氢钠内添加胎牛血清，胎牛血清通过无菌处理，且在使用前需要对胎牛血清进行常规病毒检测，碳酸氢钠和胎牛血清的比例为5:1；
34.洗脱液为70％的乙醇。
35.每3ml精子细胞内加入蛋白酶抑制剂200-300ul、细胞裂解液200-300ul、磁性二氧
化硅纳米粒子0.02-0.05ug、异硫氰酸胍50-80ul、洗涤剂100-200ul，洗脱剂100-200ul。
36.精子细胞在离体一个小时内需要进行检测，若不能及时检测，精子细胞离体后的保存温度为-20摄氏度。
37.一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂盒，包括权利要求1或2的dna提取试剂。
38.试剂盒的具体使用方法如下：
39.步骤一.首先将待检测的新鲜精子倒入试剂盒的试管内，向试管内滴加蛋白酶抑制剂，摇晃混合均匀，静置5分钟，再向试管内倒入细胞裂解液，摇晃均匀，静置20分钟，得到裂解细胞液；
40.步骤二.再向试管内加入磁性二氧化硅纳米粒子，摇晃试管，使得磁性二氧化硅纳米粒子与试管内裂解的细胞液充分混合，再向试管内滴加异硫氰酸胍，摇晃试管，使得异硫氰酸胍均匀分布在试管内。
41.步骤三.向试管内滴加洗涤剂，摇晃试管，使得洗涤剂均匀分布在试管内，再将外部磁场施加在试管外侧；
42.步骤四.再向试管内滴加洗脱液，在施加外部磁场的情况下将试管静置30-40分钟即可得到纯化的精子细胞dna。
43.对比例：
44.共选取30份精液样本，经密度梯度离心后，分离出精子细胞，用于精子细胞dna提取，30份样本平均分成实验组和对照组，实验组：为本发明的试剂盒和提取方法，对照组：不作任何处理，通过传统提取方式。
45.对比例检测结果表格：
46.47.[0048][0049]
综上本发明的试剂盒和检测试剂可以大大提高精子dna的纯度和浓度。
[0050]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。


技术特征：
1.一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，其特征在于，dna提取试剂具体包括蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、超顺磁珠、洗涤剂和洗脱液；所述蛋白酶抑制剂为苯甲酰磺酰氟和n-(反式-环氧丁二酰基)-l-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(e64)的共混物；所述细胞裂解液为非离子性聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇和二硫苏糖醇的共混物；所述超顺磁珠包括磁性二氧化硅纳米粒子、异硫氰酸胍和外部磁场；所述洗涤剂为碳酸氢钠，且碳酸氢钠内添加胎牛血清；所述洗脱液为70％的乙醇。2.根据权利要求1所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，其特征在于，所述二硫苏糖醇的摩尔浓度为1mol/l。3.一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的dna提取试剂。4.根据权利要求1所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，其特征在于，所述胎牛血清通过无菌处理，且在使用前需要对胎牛血清进行常规病毒检测。5.根据权利要求3所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的具体使用方法如下：步骤一.首先将待检测的新鲜精子倒入试剂盒的试管内，向试管内滴加蛋白酶抑制剂，摇晃混合均匀，静置5-7分钟，再向试管内倒入细胞裂解液，摇晃均匀，静置20-25分钟，得到裂解细胞液；步骤二.再向试管内加入磁性二氧化硅纳米粒子，摇晃试管，使得磁性二氧化硅纳米粒子与试管内裂解的细胞液充分混合，再向试管内滴加异硫氰酸胍，摇晃试管，使得异硫氰酸胍均匀分布在试管内。步骤三.向试管内滴加洗涤剂，摇晃试管，使得洗涤剂均匀分布在试管内，再将外部磁场施加在试管外侧；步骤四.再向试管内滴加洗脱液，在施加外部磁场的情况下将试管静置30-40分钟即可得到纯化的精子细胞dna。6.根据权利要求1所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂及试剂盒，其特征在于，精子细胞在离体一个小时内需要进行检测，若不能及时检测，精子细胞离体后的保存温度为-20摄氏度。7.根据权利要求1所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，其特征在于，每3ml精子细胞内加入蛋白酶抑制剂200-300ul、细胞裂解液200-300ul、磁性二氧化硅纳米粒子0.02-0.05ug、异硫氰酸胍50-80ul、洗涤剂100-200ul，洗脱剂100-200ul。8.根据权利要求1所述的一种提高精子细胞dna提取浓度的试剂，其特征在于，所述碳酸氢钠和胎牛血清的比例为5:1。

技术总结
本发明提供一种提高精子细胞DNA提取浓度的试剂及试剂盒，涉及DNA检测技术领域。该提高精子细胞DNA提取浓度的试剂，DNA提取试剂具体包括蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、超顺磁珠、洗涤剂和洗脱液；蛋白酶抑制剂为苯甲酰磺酰氟和N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E64)的共混物；细胞裂解液为非离子性聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇和二硫苏糖醇的共混物；所述超顺磁珠包括磁性二氧化硅纳米粒子、异硫氰酸胍和外部磁场；所述洗涤剂为碳酸氢钠，且碳酸氢钠内添加胎牛血清。本发明通过添加二硫苏糖醇和超顺磁珠，可以最大限度的将精子内的DNA提取出来，使得精子DNA浓度大大提高，有利于亲子鉴定以及刑侦时发现的少量精子检测。精子检测。


技术研发人员：韩婷婷 黄继华 孟祥黔
受保护的技术使用者：韩婷婷
技术研发日：2022.08.23
技术公布日：2022/12/29