瑞士乳杆菌菌株及含有其的用于预防或治疗炎性疾病的组合物的制作方法

1.本公开涉及一种瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)菌株和包含该菌株的用于预防或治疗炎性疾病的组合物。


背景技术：

2.由于西方化的饮食习惯，炎性肠病的发病率正在迅速增加。炎性肠病是一种肠道内的异常慢性炎症反复缓解和复发的疾病。炎性肠病包括克罗恩病(cd)、溃疡性结肠炎(uc)、肠白塞病(intestinal bechet’s disease)等。炎性肠病的确切发病机制尚未明确，已知与遗传和免疫异常以及环境因素(例如，压力、药物等)有关。
3.虽然柳氮磺胺吡啶已被用于治疗炎性肠病，但它有例如恶心、呕吐、厌食、头痛、贫血等副作用。因此，一直需要研究和开发安全且无副作用的炎性肠病治疗剂。
4.同时，近年来，正在积极研究使用被认为是安全微生物的菌类(例如，乳酸菌)来预防或治疗炎性肠病的益生菌。关于与炎性肠病的预防和治疗效果相关的乳酸菌，据报道，干酪乳杆菌(lactobacillus casei)抑制炎性细胞因子il-12或tnf-α的表达(matsumoto,s.,et al.clin exp immunol.2005,140,417-426)。此外，据报道，irt5(一种含有5种菌株(两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、干酪乳杆菌(l.casei)、嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)和嗜热链球菌(streptococcus thermophilus))的益生菌混合物)有效抑制特应性皮炎和炎性肠病模型中的炎症(kang and im,j nutr sci vitaminol.,61,2015,s103-s105)。然而，效果还没有达到商业成功的程度。
5.因此，需要继续研究对炎性肠病有效的新型菌株。


技术实现要素：

6.技术问题
7.在这种情况下，本发明人致力于开发对炎性肠病具有优异效果的新型菌株。结果，他们发现了瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)对炎性肠病表现出优异的治疗效果，从而完成了本公开。
8.解决方案
9.为了实现上述目的，根据示例性实施方式，本公开提供了一种瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)。
10.根据另一个示例性实施方式，本公开提供了一种用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，该药物组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物作为活性成分。
11.根据又一个示例性实施方式，本公开提供了一种用于预防或抑制炎性疾病的食品组合物，该食品组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物。
12.根据又一个示例性实施方式，本公开提供了一种用于预防或抑制炎性疾病的饲料组合物，该饲料组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物。
13.根据又一个示例性实施方式，本公开提供了一种预防或治疗炎性疾病的方法，该方法包括向对象施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物。
14.发明效果
15.根据本发明的瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)缓解炎性肠病中例如体重减轻和肠道长度缩短的症状，并且不具有现有药物治疗中所见的副作用。因此，瑞士乳杆菌菌株可有效用于治疗炎性疾病，特别是炎性肠病。
附图说明
16.通过以下结合附图的描述，可以更详细地理解示例性实施方式，其中：
17.图1是示出饲喂高脂饮食(hfd)的炎性肠病诱发小鼠和饲喂普通饮食(ncd)的炎性肠病诱发小鼠的体重变化的比较结果的图(**p＜0.01，ncd比hfd)；
18.图2是示出饲喂高脂饮食(hfd)的炎性肠病诱发小鼠和饲喂普通饮食(ncd)的炎性肠病诱发小鼠的的组织损伤程度(图2a)和病变程度(图2b)的评分结果的柱状图(**p＜0.01；***p＜0.001，ncd比hfd)；
19.图3是示出饲喂高脂饮食(hfd)的炎性肠病诱发小鼠和饲喂普通饮食(ncd)的炎性肠病诱发小鼠的染色的肠组织的图像；
20.图4是示出根据本发明的示例性实施方式的筛选对炎性肠病具有治疗效果的菌株的实验计划的图；
21.图5和图6是示出每只饲喂高脂饮食的炎性肠病诱发小鼠在口服施用10种乳酸菌菌株后体重变化量的图(*p＜0.05，瑞士乳杆菌比空白(mock))；
22.图7和图8是示出每只饲喂高脂饮食的炎性肠病诱发小鼠在口服施用10种乳酸菌菌株后的20天存活率的图；
23.图9是示出每只饲喂高脂饮食的炎性肠病诱发小鼠在口服施用瑞士乳杆菌mg585株或乳酸乳杆菌(l.lactis)菌株后的结肠长度的柱状图(*p＜0.05，瑞士乳杆菌比空白)；
24.图10是示出每只饲喂高脂饮食的炎性肠病诱发小鼠在口服施用瑞士乳杆菌mg585株或乳酸乳杆菌菌株后的结肠长度的图像；以及
25.图11示出了每只饲喂高脂饮食的炎性肠病诱发小鼠在口服施用瑞士乳杆菌mg585株或乳酸乳杆菌菌株后的染色的肠组织的图像。
26.最佳实施方式
27.在下文中将详细描述具体实施方式。
28.根据本发明的一个方面提供了一种瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc14110bp)。
29.乳杆菌(lactobacillus)是一种广泛分布于自然界的需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性的杆菌属微生物。属于乳杆菌属的微生物包括瑞士乳杆菌、清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)等。本发明人筛选出一种对炎性疾病，特别是炎性肠病有极好的治疗效果的新型瑞士乳杆菌菌株，并将其命名为“瑞士乳杆菌mg585”。该菌株于2020年1月14日以保藏号kctc 14110bp保藏于韩国生命工学研究院(kribb)韩国典型菌种保藏中心(kctc)以用于国际专利。此外，该菌株属于益生菌菌株，对人体无害，并且可无副作用地使用。
30.如本文所用，术语“瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)mg585”也可以描述为瑞士乳杆菌(l.helveticus)mg585或瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)菌株(保藏号kctc 14110bp)。
31.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，该药物组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物作为活性成分。
32.瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)与上述相同。在这种情况下，菌株可以是活的或死的，并且优选活菌株。
33.菌株的培养物可以含有也可以不含有菌株，优选含有菌株。此外，菌株的培养物可以是裂解物的形式。
34.基于组合物的总重量，该组合物包括治疗有效量或营养有效浓度的活性成分瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物，并且优选地，其含量为108cfu/g至10
12
cfu/g，或包括具有等量活菌株的培养物。一般而言，对于成年患者，可以一次或分几次施用1
×
106cfu/g或更多的活菌株，优选1
×
108至1
×
10
12
cfu/g的活菌株。
35.根据本发明的示例性实施方式，瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)可以是一种对炎性肠病具有治疗效果的菌株。具体来说，在根据本发明的示例性实施方式中，当给炎性肠病诱发小鼠口服施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc14110bp)时，小鼠显示出体重增加。相反，当每只小鼠口服施用9种不同的乳酸菌菌株时，这些小鼠表现出体重下降(图5和图6)。此外，在口服施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)的实验组中，没有小鼠死亡。相比之下，口服施用各个剩余的9种乳酸菌菌株的实验组中的小鼠在15天后存活率迅速下降(图7和图8)。此外，通过测量，口服施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc14110bp)的小鼠显示出结肠长度最长。同时，口服施用乳酸乳杆菌菌株的小鼠显示出结肠长度减少(图9和图10)。此外，对口服施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)的小鼠的肠组织进行组织学分析的结果是观察到均匀的肠组织(图11)。
36.如本文所用，术语“炎症”是指保护生物体免受有害因素影响的反应，包括免疫细胞、血管和炎症介质参与以抑制细胞损伤；去除受损组织和坏死细胞；以及使组织再生的一系列过程。术语“炎性疾病”是对以炎症为主要病变的疾病的统称。
37.炎性疾病可以是选自由炎性肠病、系统性红斑狼疮、硬皮病、特应性皮炎、银屑病、过敏反应、皮炎、糖尿病性视网膜病、视网膜炎、黄斑变性、葡萄膜炎、结膜炎、关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、骨质疏松症、过敏症、糖尿病、糖尿病性肾病、肾盂炎、肾炎、干燥综合征(sjogren syndrome)、自身免疫性胰腺炎、牙周病、哮喘、移植物抗宿主病、慢性盆腔炎、子宫内膜炎、鼻炎、移植排斥和慢性前列腺炎组成的组中的任一种。
38.炎性肠病可以是选自由克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠白塞病和肠炎组成的组中的任一种疾病。
39.如本文所用，术语“炎性肠病”是指引起胃肠道中慢性炎症的疾病，它可以包括发生在肠道中的所有炎性疾病，例如传染性肠炎(如细菌性、病毒性、阿米巴性肠炎、结核性肠炎等)、缺血性肠病和放射性肠炎。尽管炎性肠病的病因尚未明确，但已知它受到遗传和环境的影响，并由免疫异常介导。
40.如本文所用，术语“克罗恩病”是指慢性炎性肠病，其发生在从口腔到肛门的整个胃肠道中。作为一种自身免疫疾病，克罗恩病多发生于小肠与大肠交界处的回盲部，多发于
大肠、回肠末端、小肠等。克罗恩病的特征在于反复出现症状期(在此期间出现例如腹痛和腹泻的症状)和无症状期。尽管克罗恩病的确切病因尚未阐明，但认为与分枝杆菌感染、麻疹病毒感染、消化道内对正常细菌的过度免疫反应等有关。
41.如本文所用，术语“溃疡性结肠炎”是指一种主要侵犯粘膜并形成糜烂或溃疡的弥漫性非特异性炎性疾病。溃疡性结肠炎的病因尚未明确，它会引起各种全身性症状，如血性腹泻。
42.如本文所用，术语“白塞病”是指口腔和生殖器溃疡和眼部炎症反复发生的疾病，是涉及心血管系统、神经系统、消化道、肝、脾、肾和肺的全身性慢性疾病。当白塞病侵入肠时，称为“肠白塞病”。“肠白塞病”是一种非特异性、复发性慢性炎性疾病，伴有例如腹痛、腹泻的症状，还可伴有例如出血和穿孔的并发症。
43.如本文所用，术语“预防”是指通过施用组合物来抑制或延缓目标疾病的发生、传播和复发的任何作用。如在本公开中使用的术语“预防”是指通过施用组合物来缓解或有益地改变目标疾病的症状的任何作用。具体而言，该作用包括治愈、缓解、防止、预防、延缓或减少由炎性疾病引起的症状。
44.根据本发明的药物组合物可以与至少一种药学上可接受的载体配制成合适的形式，并且可以进一步包含冷冻保护剂、赋形剂或稀释剂。术语“药学上可接受的”是指其在生理上是可接受的，并且当施用至人时通常不会引起严重的胃肠道疾病、头晕、过敏反应或类似反应。
45.具体地，冷冻保护剂可以是选自由甘油、海藻糖、麦芽糖糊精、脱脂奶粉和淀粉组成的组中的至少一种。此外，赋形剂可以是选自由葡萄糖、糊精和脱脂奶粉组成的组中的一种或多种。
46.基于组合物的总重量，组合物可以包含：0.01wt％至20wt％、0.01％wt％至10wt％的冷冻保护剂，具体地，在组合物中，可以5wt％至20wt％的量包含甘油，可以2wt％至10wt％的量包含海藻糖，可以2wt％至10wt％的量包含麦芽糖糊精，可以0.5wt％至2wt％的量包含脱脂奶粉，可以0.1wt％至1wt％的量包含淀粉。此外，基于组合物的总重量，组合物可以包含75wt％至95wt％或85wt％至95wt％的赋形剂。
47.可以包含在药物组合物中的载体和稀释剂的例子可以包括阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。当配制时，使用稀释剂或赋形剂(例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)来制备药物组合物。
48.此外，作为药学上可接受的载体，可以进一步包括用于口服施用的载体。用于口服施用的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。合适的稳定剂是抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂是苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。根据本发明的药物组合物除了上述成分以外，还可以含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、助悬剂等。
49.根据本发明的组合物可以通过任何方法施用于包括人在内的哺乳动物。例如，可以口服施用根据本发明的组合物。
50.本发明的药物组合物可以根据上述施用途径制成用于口服施用的制剂。
51.在用于口服施用的制剂的情况下，可以使用本领域已知的方法将根据本发明的组
合物配制成粉末剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、溶液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。例如，对于口服制剂，将活性成分与固体赋形剂混合，然后将混合物粉碎并添加合适的补充剂，然后将所得物加工成颗粒混合物以获得片剂或糖衣片剂。合适的赋形剂的例子可以包括：糖类(包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇等)；淀粉类(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉等)；纤维素类(包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素等)；和填料(例如，明胶、聚乙烯吡咯烷酮等)。此外，在某些情况下，可以添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸、海藻酸钠等作为崩解剂。此外，根据本发明的药物组合物还可包含抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
52.根据本发明的药物组合物可以药学有效量施用。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗或预防的合理收益/风险比治疗或预防疾病的量。有效剂量水平可根据包括以下的因素确定：疾病的严重程度；药物的活性；患者的年龄、体重、健康状况、性别和对药物的敏感性；使用的根据本发明的组合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗时间；与使用的根据本发明的组合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的其他因素。
53.根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。药物组合物可以单剂量或多剂量施用。考虑到上述所有因素，重要的是施用能够以最小量达到最大效果而没有副作用的量。
54.根据本发明的药物组合物的制剂、施用途径和施用方法没有特别限制，只要该药物组合物表现出根据本发明的效果即可。
55.本发明的另一方面提供了一种用于预防或抑制炎性疾病的食品组合物，该食品组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)或其培养物。
56.瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)与上述相同。
57.食品组合物包括所有形式，例如功能性食品、营养补充剂、保健食品、食品添加剂等，并且食品组合物的种类可以按照本领域公知的常规方法制备成各种形式。
58.在将该菌株用作食品添加剂的情况下，该菌株可以照原样添加，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、保健或治疗性处理)来适当确定。通常，在制备食品或饮料时，活性成分可以以含有该菌株的原料组合物的0.0001wt％至1wt％，特别是0.001wt％至0.1wt％的量添加。但是，在为了保健和卫生或健康控制目的而长期摄入的情况下，使用量甚至可以等于或低于上述范围。
59.本发明的另一方面提供了一种用于预防或抑制炎性疾病的饲料组合物，该饲料组合物包含瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)或其培养物。
60.瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)与上述相同。
61.用于预防或抑制炎性疾病的饲料组合物可以根据本领域已知的各种饲料制备方法，通过添加适当有效浓度范围的瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14105bp)来制备。
62.本发明的又一个方面提供了一种预防或治疗炎性疾病的方法，该方法包括向对象施用瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物。
63.对象可患有炎性疾病。此外，对象可以是哺乳动物，优选人。在这种情况下瑞士乳
杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)与上述相同。此外，菌株或其培养物的施用途径、施用剂量和施用频率以及炎性疾病的类型如上所述。
64.本发明的再一方面提供了瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)或其培养物治疗炎性疾病的用途。
65.在这种情况下瑞士乳杆菌菌株(保藏号kctc 14110bp)与上述相同。另外，炎性疾病的种类如上所述。
具体实施方式
66.下文将通过以下实施例更为详细地描述本公开。然而，以下实施例仅用于说明本公开，并且本发明的范围不受以下实施例的限制。
67.实施例1.高脂饮食导致炎性肠病恶化的确认
68.在用60％高脂饮食(hfd)饲喂c57bl/6小鼠10周后，允许小鼠随意接触混合物(其中2％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss，mpbio，美国)与饮用水混合)6天。然后，允许小鼠饮水2天，并将这些小鼠作为实验组。将饲喂正常饲料(ncd)而不是高脂饮食的小鼠作为对照组。
69.之后，比较对照组和实验组的体重变化量(％)，结果发现饲喂高脂饮食的实验组小鼠的体重减轻更多(图1)。
70.此外，处死对照组和实验组小鼠后，提取它们的肠组织并用10％中性缓冲福尔马林固定。之后，制备石蜡切片并用苏木精和伊红(h&e)染色，然后进行组织学分析。除显微观察外，还进行组织学分析以根据组织损伤和障碍程度分为1至5分来评估切片。评分越高，损伤或障碍程度越高。
71.结果，与对照组相比，在实验组的肠组织中观察到由于炎性反应而导致的不规则组织形态，并且测量到的组织损伤和障碍评分也更高(图2和图3)。
72.实施例2.筛选对炎性肠病有治疗效果的菌株并确认治疗效果
73.使用小鼠模型，在购自麦迪欧肯股份有限公司(mediogen co.,ltd.,)的10种乳酸菌菌株中筛选出对炎性肠病具有治疗效果的乳酸菌。
74.实施例2.1.体重变化的比较
75.在用60％高脂饮食(hfd)饲喂c57bl/6小鼠12周后，允许小鼠从第十周开始随意接触混合物(其中2％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss，mpbio，美国)与饮用水混合)一周。然后，从第11周开始，允许小鼠随意接触混合物(其中3％(w/v)葡聚糖硫酸钠与饮用水混合)约10天。将仅饲喂60％高脂饮食的小鼠作为对照组(空白)。每只小鼠口服施用5
×
109cfu的每种乳酸菌，间隔2至3天，持续12周。之后，为了确定作为炎性肠病的典型症状之一的体重减轻症状是否得到缓解，测量了对照组和实验组的体重变化量(图4)。
76.结果，与对照组小鼠相比，口服施用瑞士乳杆菌mg585菌株的实验组小鼠显示出它们的体重增加。其间，除了瑞士乳杆菌mg585菌株以外，口服施用其余9种各乳酸菌菌株的实验组小鼠与对照组小鼠相比体重减轻(图5和图6)。
77.实施例2.2存活率的比较
78.在上述实施例2.1中，比较了对照组小鼠(空白)和实验组小鼠从第10周开始口服葡聚糖硫酸钠和各乳酸菌时的存活率。
79.结果，在口服施用瑞士乳杆菌mg585菌株的实验组中，没有小鼠死亡。其间，除了瑞
士乳杆菌mg585菌株以外，在口服施用其余9种各乳酸菌菌株的实验组小鼠中，15天后存活率急剧下降(图7和图8)。
80.实施例2.3.肠长度的比较
81.为了确认炎性肠病的代表症状之一的肠长度缩短的症状是否得到缓解，从口服施用瑞士乳杆菌mg585菌株(在上述实施例2.1和实施例2.2中最有效的)的实验组小鼠和口服施用乳酸乳杆菌菌株(在上述实施例2.1和实施例2.2中最无效的)的实验组小鼠中提取肠，并测量了它们的结肠长度。此时，还从对照组(空白)小鼠中提取肠以比较结肠长度。
82.测量结果显示出口服施用瑞士乳杆菌mg585菌株的实验组小鼠的结肠长度最长，而对照组小鼠和口服施用乳酸乳杆菌菌株的实验组小鼠的结肠长度变短(图9和图10)。
83.实施例2.4.通过组织学分析进行比较
84.将实施例2.3中提取的肠组织用10％中性缓冲福尔马林固定。之后，制备石蜡切片并用苏木精和伊红(h&e)染色，然后进行组织学分析。
85.结果，在对照组小鼠(空白)和口服施用乳酸乳杆菌菌株的实验组小鼠中观察到由炎性反应引起的不规则肠组织，而在口服施用瑞士乳杆菌mg585菌株的实验组小鼠中观察到均匀的肠组织(图11)。
86.由此，确认了在10种乳酸菌菌株中瑞士乳杆菌mg585菌株表现出对炎性肠病的优异的治疗效果。
87.《保藏号》
88.保藏机构：韩国生命工学研究院韩国典型菌种保藏中心(kctc)
89.保藏号：kctc14110bp
90.保藏日期：2020年1月14日。
91.