一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法

本发明涉及环境污染监测领域，更具体地说涉及微囊藻毒素的即时检测应用。

背景技术：

1、微囊藻毒素是一类结构稳定的单环七肽化合物，主要由微囊藻属、鱼腥藻、念珠藻属等产生，是淡水水体中出现频率最高、分布最广、造成危害最严重的一类藻毒素。目 前，在自然界中共发现200多种微囊藻毒素的同分异构体，其生物活性所必需的基团为 adda基团，不同亚型的微囊藻毒素毒性不同，其中以mc-lr、mc-rr、mc-yr在自然 水体中含量最高，毒性最大。国内外多项研究表明，微囊藻毒素通过打破细胞内蛋白磷 酸化平衡，引发肝脏病变，促进肝癌的发生率，已有研究证实微囊藻毒素具有生殖毒性、 神经毒性和遗传毒性，世界卫生组织对饮用水中微囊藻毒素mc-lr的限值为1.0μg/l， 可耐受的每日摄取量为0.04μg/(kg·d)。因此，建立快速、高效、稳定的微囊藻毒素检测 方法成为当务之急。

2、传统微囊藻毒素检测方法有高效液相色谱法和酶联免疫吸附法，具有检测环境要求 高、成本高、耗时长的不足。其中，高效液相色谱法(最低10元/样，耗时6h以上)是 测定微囊藻毒素浓度常见方法，由于水体中藻毒素浓度较低，需对样品富集浓缩后再通 过高效液相色谱测定，一般需要利用c18固相萃取小柱进行藻毒素萃取，利用甲醇洗脱 后测定；酶联免疫吸附法(最低10元/孔，耗时4h以上)原理为在包被微囊藻毒素抗体 微孔中，依次加入样品、标准品、hrp标记检测抗体，在恒定温度下培育并反复洗涤。 底物tmb与过氧化物酶反应显示蓝色，然后在酸的作用下转化为黄色。通过酶标仪测定 样品在450nm时的吸光度，并计算浓度。相比于高相液相色谱法，酶联法前处理操作简 单且所需样本体积量小，方法检出限为0.1μg/l，较适用于低藻毒素浓度的测定。因此， 开发高效微囊藻毒素检测方法，进一步降低检测成本，提高检测速度具有重要的科学意 义和应用前景。

3、环介导恒温扩增(lamp)法，通过特异性引物与蓝藻细胞内mcy基因簇的反应， 在恒温条件下(60-65℃)高效扩增目标dna，主要使用凝胶电泳法、金属离子指示剂 法和浊度法等方法进行表征。其中，凝胶电泳法与传统pcr类似，在扩增反应之后，将 微量的反应物上样于琼脂糖凝胶，在电场下简单分离后利用核酸染料染色，从而根据是 否得到特征的阶梯状条带来判断是否发生有效扩增，但该方法耗时较长、极易受到气溶 胶污染；浊度法利用扩增过程中dna聚合反应的副产物焦磷酸根离子与镁离子结合，形 成白色的不溶沉淀物，产生肉眼可见的浑浊，但该方法不利于对大批量样品进行同时分 析；金属离子指示剂法是在浊度法的基础上衍生出来的，钙黄绿素就是其典型代表，锰 离子(mn2+)和钙黄绿素混合加入反应液，扩增反应前，mn2+与钙黄绿素结合并淬灭其 荧光，随着扩增反应进行，扩增副产物焦磷酸根离子不断产生并和钙黄绿素竞争结合mn2+， 使得与钙黄绿素结合的mn2+脱落，钙黄绿素荧光恢复，从而产生黄绿色荧光信号。该方 法是一种扩灵敏度、特异性高、成本低、高效的核酸恒温扩增技术。在该方法中，除特 异性引物外，钙黄绿素是该方法成功与否的决定性因素。所以研究钙黄绿素的配比，有 望提高lamp法检测水体中微囊藻毒素的稳定性。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术中的不足，传统微囊藻毒素检测方法存在成本高、检测环境 要求高、耗时长的问题，提供了一种高效、特异性高、成本低的检测方法，通过对钙黄 绿素配比改良，大幅度提高了lamp法检测微囊藻毒素的成功率并降低了检测时长；同时， 该检测技术仅需干燥箱或者水浴装置，设备要求较低，易于推广应用。

2、本发明的目的通过下述方案予以实现。

3、lamp荧光淬灭法反应各组分浓度为：内引物fip和bip各1.6μmol/l，外引物f3 和b3各0.2μmol/l，环引物lf和lb各0.8μmol/l，dntps 1.0-1.6mmol/l，甜菜碱0.8mol/l，tris-hcl(ph值8.8)20mmol/l，氯化钾(kcl)10mmol/l，硫酸铵((nh4)2so4)10mmol/l， 硫酸镁(mgso4)8mmol/l，tween200.1％，bstdna聚合酶大片段8u，dna模板2μl， 钙黄绿素荧光试剂2μl，超纯水定容至25μl。阴性对照管不加dna模板。反应程序： 将反应物60-65℃恒温保持40-70min，80℃灭活10min。通过反应物中钙黄绿素的颜色 变化(对于阳性反应，橙色变成绿色，阴性则不变色)来判断水体中是否含有微囊藻毒 素。

4、所述dna为铜绿微囊藻、念珠藻、华美微囊藻中的一种。

5、所述钙黄绿素荧光试剂为钙黄绿素和氯化锰(mncl2)的混合液，配比为20∶1、25∶1、 30∶1。

6、所述丝状念珠藻、单细胞铜绿微囊藻、单细胞华美微囊藻产生的微囊藻毒素lamp检测引物组采用包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：

7、所述的一对外引物，其核苷酸序列为：

8、f3：ctgaaacttgctcgccag

9、b3：ctatcgtatttttaggaattatggc

10、所述的一对内引物，其核苷酸序列为：

11、fip：ggtctcctaactttgcattttcctt

12、tttt gaggagaggttataagagacgt

13、bip：gcttacttgatgcttttgaatgagt tttt aaattcatgttcccatggaat

14、所述的一对环引物，其核苷酸序列为：

15、lf：aacaggccgaagaacttaagc

16、lb：taaccattgcagaggttggc

17、本发明的有益效果为：通过对钙黄绿素荧光试剂、dntps以及lamp法反应条件的优化，大幅度提高了lamp法检测微囊藻毒素的效率，检测时间缩短至1h以内；同时， 该方法操作简单，设备要求低，效率高，易于推广应用。

技术特征：

1.一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法，其特征在于：锰离子(mn2+)和钙黄绿素混合加入反应液，扩增反应前，mn2+与钙黄绿素结合并淬灭其荧光，随着扩增反应进行，扩增副产物焦磷酸根离子不断产生并和钙黄绿素竞争结合mn2+，使得与钙黄绿素结合的mn2+脱落，钙黄绿素荧光恢复，从而产生黄绿色荧光信号。按照下述步骤进行：

2.根据权利要求1所述的一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述dna采用铜绿微囊藻、华美微囊藻、念珠藻中的一种，dna初始浓度分别为339.915、53.945、210.715ng/μl；稀释dna所用溶剂为超纯水。

3.根据权利要求1所述的一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述dntps浓度为1.0-1.6mmol/l，所述钙黄绿素荧光试剂为钙黄绿素和氯化锰(mncl2)的混合液，配比为20∶1、25∶1、30∶1。

4.根据权利要求1所述的一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述反应温度为60-65℃，反应时间为40-70min，灭火温度为80℃，灭活时间为10min。

5.根据权利要求1-4所述的一种利用环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的方法应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于环介导等温荧光淬灭法检测微囊藻毒素的灵敏度极高，当dna浓度稀释至107时，lamp法显色为绿色。

技术总结
本发明提供一种快速检测水中是否存在潜在微囊藻毒素风险的方法及其应用，环介导等温扩增法检测技术(LAMP)以微囊藻毒素合成基因(mcyG)为模板设计LAMP引物并进行特异性和灵敏度检验。LAMP荧光淬灭法反应各组分为：内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，dNTPs，甜菜碱，Tris‑HCl(pH值8.8)，KCl，(NH<subgt;4</subgt;)<subgt;2</subgt;SO<subgt;4</subgt;，MgSO<subgt;4</subgt;，Tween20，BstDNA聚合酶大片段，DNA模板，钙黄绿素荧光试剂。通过对钙黄绿素荧光试剂进行改进，大幅度提高了显色效率；通过对反应条件进行优化，节约了时间；该方法操作方法简便，设备要求较低，易于推广应用。

技术研发人员：黄兰兰,杨宁,童银栋
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11