一种分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺。


背景技术：

2.目前传统的石油基聚合物材料在处置过程中会释放有毒物质和温室气体，塑料在合理的时间范围内无法降解，对环境和生态系统造成了严重的污染。我国塑料产量达6000万吨以上，其中泡沫塑料240万吨，很大一部分用于包装材料。因此人们对“绿色”材料和生产工艺的需求日益增长。
3.目前主流的生物降解塑料主要包括利用生物技术直接制取的高分子材料，如聚羟基脂肪酸酯(pha)等；生物原料再经聚合得到的高分子材料，如聚乳酸(pla)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)等；此外还有淀粉基生物降解塑料、二氧化碳共聚脂肪族塑料(ppc)等。然而与传统塑料相比，生物降解塑料通常机械性能较差，不耐高温、生产成本及价格普遍较高，部分共混型材料降解后塑料微粒长期留存，粮食型材料存在“与人争粮”问题。寻找新型可降解、安全、成本低廉的生物降解塑料制品一直是研究的热点与重点。
4.因此，开发良好环境兼容性的绿色缓冲包装材料已成为世界包装可持续发展的主流。目前有一种缓冲包装材料是以农作物为原料，接种真菌菌种，利用菌丝体的生长特性，通过菌丝连接形成疏松多孔的缓冲结构，制成一种绿色环保的可降解缓冲包装材料。目前现有技术仅仅公开了该材料的形成原理和生产工艺，但由于其原料组成、制备方法上存在的不足，基于现有公布技术制备得到的缓冲包装材料，材料内部菌丝量低，粘结性差，导致材料静缓冲性能差、易断裂，不能较好地作为缓冲包装材料使用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺。
6.本发明还要解决的技术问题是利用上述食用菌发酵工艺在制备缓冲包装材料中的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺，将食用菌菌种接入种子液中培养后，再将食用菌种子液接种至固态基质中，搅拌均匀。密封后进行固态发酵制备菌丝体。
8.其中，所述的种子液包含诱导物秸秆粉，其诱导物秸秆粉为玉米秸秆粉、小麦秸秆粉、稻秸秆粉、芦苇秸秆粉、高粱秸秆粉中的任意一种或几种的组合，优选的为玉米秸秆粉。
9.具体的，由于菌株在生长过程中需要通过菌丝末端捕获多糖代谢利用，而相较于易于利用葡萄糖或其它纯多糖，秸秆内的纤维多糖利用则需要菌丝渗透至秸秆内部才能消化吸收这部分糖源，这一过程会刺激细胞壁提高具有刚性的几丁质浓度，因此秸秆粉能作为诱导几丁质高分泌的诱导物。
10.其中，所述的固态基质，包括如下重量百分比的组分：秸秆20～80％，木屑20％～
80％、麸皮5％～25％。优选的为玉米秸秆40％，木屑40％、麸皮20％。
11.其中，所述的食用菌菌种预先经过培养和纯化处理，方法为：将食用菌切片接入固态平板培养基中25℃下培养，待菌丝体长满平板后，挑取无杂菌的菌丝体转接入种子液中25℃、170rpm下继续培养，直至菌液生物量大于15g/l，再转接入新的固态平板培养基中进行划线培养。挑取单菌落继续在新的固态平板培养基中培养，得到分纯后的食用菌菌种。
12.具体的，所述的食用菌为平菇、草菇、茶树菇、金针菇、杏鲍菇、猴头菇、羊肚菌、灵芝中的任意一种或几种的组合，优选的为灵芝，最优选的为泰山赤芝。
13.具体的，所述的固态平板培养基，配方如下：葡萄糖(基础碳源)20g/l，硫酸二氢钾3g/l，七水硫酸镁1.5g/l，维生素b1 0.1g/l，琼脂15g/l，酵母粉(基础氮源)7.6g/l。
14.具体的，所述的种子液，配方如下：氮源0.9-1.1g/l，碳源21-25g/l，秸秆粉1～5g/l(诱导物)，mgso
4 0.4g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，kh2po
4 0.1g/l，vb1 0.01g/l。优选的碳源含量为25g/l，氮源含量为1.1g/l，秸秆粉含量为1.5g/l。
15.具体的，所述的种子液，其碳源为葡萄糖、半纤维素、玉米淀粉和商品纸浆中的任意一种或几种的组合，优选的为玉米淀粉。
16.具体的，所述的种子液，其氮源为酵母粉、酵母浸膏、氨基酸发酵废液和玉米浆中的任意一种或几种的组合，优选的为氨基酸发酵废液。
17.具体的，所述的种子液，其秸秆粉粒径包括12目、60目、150目和200目中的任意一种，优选的为150目。
18.具体的，所述的种子液，其几丁质含量通过红外半定量进行分析，根据1371cm-1
几丁质吸收峰的高低比较几丁质含量浓度(参考文献haneef m,ceseracciu l,canale c,et al.advanced materials from fungal mycelium:fabrication and tuning of physical properties[j].rep,2017,7:41292.)。当吸收峰高时，表示几丁质含量浓度高；当吸收峰低时，表示几丁质含量浓度低。
[0019]
具体的，将食用菌菌种接入种子液中25～28℃，170rpm下培养5-10天后，再将食用菌种子液按16％～23％体积比接种至固态基质中，填入模具，密封模具并置于摇床上静置培养进行固态发酵制备菌丝体，固态发酵温度为25～32℃，固态发酵时间为5-10天。优选的种子液培养温度为25℃，培养时间为7天，优选的食用菌种子液按20％体积比接种至固态基质，优选的固态发酵的发酵温度为25℃，发酵时间为7天。
[0020]
其中，制备得到的菌丝体经脱模，烘干灭活，得到秸秆菌丝体材料，其材料密度为0.181-0.201g/cm3，压缩强度为0.32-0.45mpa。优选的材料密度为0.183g/cm3，压缩强度为0.45mpa。。
[0021]
具体的，固态发酵结束后，脱模取出已经定型且表面长满白色菌丝体的材料，将该材料置于70℃烘箱中干燥脱水处理20h的同时，灭活基质内部的菌，使其停止生长，得到秸秆菌丝体材料。
[0022]
具体的，将得到的秸秆菌丝体材料进行力学性能及密度检测：力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。
[0023]
所述的分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺制备得到的秸秆菌丝体材料也在本发明的保护范围之内。
[0024]
所述的秸秆菌丝体材料在制备缓冲包装材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0025]
有益效果：
[0026]
(1)材料的力学性能直接是由菌丝的量决定，表面菌丝越多，材料的性能越坚固。本发明通过优化分泌表达产几丁质的食用菌发酵工艺，使固态基质表面菌丝富集量高于普通发酵工艺，通过菌丝体对秸秆进行固定和包裹，得到了粘结性好，性能稳定，不易断裂的秸秆菌丝体材料。
[0027]
(2)几丁质决定着秸秆菌丝体材料的力学性能，本发明以秸秆粉作为几丁质诱导物，有效提高了种子液中几丁质的含量，使材料的坚固性、稳定性得到了有效的提高。
附图说明
[0028]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0029]
图1为表面几乎无菌丝(左)与表面长满菌丝(右)的秸秆菌丝体材料对比图
[0030]
图2为最优碳氮源配方(2a)和普通碳氮源配方(2b)秸秆菌丝体材料内部基质的sem图。
[0031]
图3为在种子液培养基中，不添加玉米秸秆粉、添加不同粒径的玉米秸秆粉作为几丁质诱导物时，种子液中菌球的红外对比图(其中红色为添加的诱导物为最优粒径的150目的玉米秸秆粉，绿色为添加的诱导物为粒径60目的玉米秸秆粉，蓝色为未添加诱导物玉米秸秆粉)。
具体实施方式
[0032]
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0033]
下述实施例中，所用菌株材料泰山赤芝、平菇草屑28、金针菇f3、草菇v901均购自天达食用菌研究所。
[0034]
实施例1：分泌表达产几丁质的泰山赤芝(灵芝)发酵工艺及其应用
[0035]
在超净工作台下将泰山赤芝切片接入固态平板培养基中25℃下培养。待菌丝体长满平板后，挑取无杂菌的菌丝体转接入种子液培养基中25℃、170rpm下继续培养，直至菌液浓稠，再转接入新的平板进行划线培养。挑取单菌落继续在新的平板中培养，得到分纯后的泰山赤芝菌种。
[0036]
将泰山赤芝菌种接入种子液培养基中，25℃、170rpm下培养7天左右。在超净台中将上述培养结束所得种子液按照固态基质体积的20％接种至固态基质(接种前先进行灭菌处理：121℃、15min)，搅拌均匀后填入模具，模具封口并置于25℃摇床中静置培养7天，进行固态发酵制备菌丝体材料。
[0037]
其中固态平板培养基，配方如下：葡萄糖(基础碳源)20g/l，硫酸二氢钾3g/l，七水硫酸镁1.5g/l，维生素b1 0.1g/l，琼脂15g/l，酵母粉(基础氮源)7.6g/l。
[0038]
其中种子液培养基，配方如下：氮源1.1g/l，碳源25g/l，玉米秸秆粉1.5g/l(诱导物)，mgso
4 0.4g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，kh2po
4 0.1g/l，vb1 0.01g/l。氮源为氨基酸发酵
废液，碳源为玉米淀粉，秸秆粉粒径为150目。
[0039]
其中固态基质包括如下重量百分比的组分：玉米秸秆40％，木屑40％、麸皮20％。
[0040]
固态发酵结束后，脱模取出已经定型且表面长满白色菌丝的秸秆菌丝体材料(如图1所示)，将该材料置于70℃烘箱中干燥脱水处理20h，同时达到灭活基质内部的菌的目的，使其停止生长。
[0041]
对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.183g/cm3；压缩强度：0.45mpa。
[0042]
实施例2：分泌表达产几丁质的平菇草屑28发酵工艺及其应用
[0043]
在超净工作台下将平菇草屑28切片接入固态平板培养基中25℃下培养。待菌丝体长满平板后，挑取无杂菌的菌丝体转接入种子液培养基中25℃、170rpm下继续培养，直至菌液浓稠，再转接入新的平板进行划线培养。挑取单菌落继续在新的平板中培养，得到分纯后的平菇草屑28菌种。
[0044]
将平菇草屑28菌种接入种子液培养基中，25℃、170rpm下培养5天左右。在超净台中将上述培养结束所得种子液按照固态基质体积的20％接种至固态基质(接种前先进行灭菌处理：121℃、15min)，搅拌均匀后填入模具，模具封口并置于25℃摇床中静置培养5天，进行固态发酵制备菌丝体材料。
[0045]
其中固态平板培养基，配方如下：葡萄糖(基础碳源)20g/l，硫酸二氢钾3g/l，七水硫酸镁1.5g/l，维生素b1 0.1g/l，琼脂15g/l，酵母粉(基础氮源)7.6g/l。
[0046]
其中种子液培养基，配方如下：氮源0.9g/l，碳源21g/l，玉米秸秆粉1.5g/l(诱导物)，mgso
4 0.4g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，kh2po
4 0.1g/l，vb1 0.01g/l。氮源为氨基酸发酵废液，碳源为玉米淀粉，秸秆粉粒径为150目。
[0047]
其中固态基质包括如下重量百分比的组分：玉米秸秆40％，木屑40％、麸皮20％。
[0048]
固态发酵结束后，脱模取出已经定型且表面长满白色菌丝的秸秆菌丝体材料，将该材料置于70℃烘箱中干燥脱水处理20h，同时达到灭活基质内部的菌的目的，使其停止生长。
[0049]
对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.191g/cm3；压缩强度：0.43mpa(25％形变)。
[0050]
实施例3：分泌表达产几丁质的草菇v901发酵工艺及其应用
[0051]
在超净工作台下将草菇v901切片接入固态平板培养基中25℃下培养。待菌丝体长满平板后，挑取无杂菌的菌丝体转接入种子液培养基中25℃、170rpm下继续培养，直至菌液浓稠，再转接入新的平板进行划线培养。挑取单菌落继续在新的平板中培养，得到分纯后的草菇v901菌种。
[0052]
将草菇v901菌种接入种子液培养基中，25℃、170rpm下培养7天左右。在超净台中将上述培养结束所得种子液按照固态基质体积的20％接种至固态基质(接种前先进行灭菌处理：121℃、15min)，搅拌均匀后填入模具，模具封口并置于25℃摇床中静置培养7天，进行固态发酵制备菌丝体材料。
[0053]
其中固态平板培养基，配方如下：葡萄糖(基础碳源)20g/l，硫酸二氢钾3g/l，七水
硫酸镁1.5g/l，维生素b1 0.1g/l，琼脂15g/l，酵母粉(基础氮源)7.6g/l。
[0054]
其中种子液培养基，配方如下：氮源0.9g/l，碳源21g/l，玉米秸秆粉1.5g/l(诱导物)，mgso
4 0.4g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，kh2po
4 0.1g/l，vb1 0.01g/l。氮源为氨基酸发酵废液，碳源为玉米淀粉，秸秆粉粒径为150目。
[0055]
其中固态基质包括如下重量百分比的组分：玉米秸秆40％，木屑40％、麸皮20％。
[0056]
固态发酵结束后，脱模取出已经定型且表面长满白色菌丝的秸秆菌丝体材料(如图1所示)，将该材料置于70℃烘箱中干燥脱水处理20h，同时达到灭活基质内部的菌的目的，使其停止生长。
[0057]
对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.189g/cm3；压缩强度：0.43mpa(25％形变)。
[0058]
实施例4：分泌表达产几丁质的金针菇f3发酵工艺及其应用
[0059]
在超净工作台下将金针菇f3切片接入固态平板培养基中25℃下培养。待菌丝体长满平板后，挑取无杂菌的菌丝体转接入种子液培养基中25℃、170rpm下继续培养，直至菌液浓稠，再转接入新的平板进行划线培养。挑取单菌落继续在新的平板中培养，得到分纯后的金针菇f3菌种。
[0060]
将金针菇f3菌种接入种子液培养基中，28℃、170rpm下培养10天左右。在超净台中将上述培养结束所得种子液按照固态基质体积的20％接种至固态基质(接种前先进行灭菌处理：121℃、15min)，搅拌均匀后填入模具，模具封口并置于25℃摇床中静置培养10天，进行固态发酵制备菌丝体材料。
[0061]
其中固态平板培养基，配方如下：葡萄糖(基础碳源)20g/l，硫酸二氢钾3g/l，七水硫酸镁1.5g/l，维生素b1 0.1g/l，琼脂15g/l，酵母粉(基础氮源)7.6g/l。
[0062]
其中种子液培养基，配方如下：氮源0.9g/l，碳源21g/l，玉米秸秆粉1.5g/l(诱导物)，mgso
4 0.4g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，kh2po
4 0.1g/l，vb1 0.01g/l。氮源为氨基酸发酵废液，碳源为玉米淀粉，秸秆粉粒径为150目。
[0063]
其中固态基质包括如下重量百分比的组分：玉米秸秆40％，木屑40％、麸皮20％。
[0064]
固态发酵结束后，脱模取出已经定型且表面长满白色菌丝的秸秆菌丝体材料，将该材料置于70℃烘箱中干燥脱水处理20h，同时达到灭活基质内部的菌的目的，使其停止生长。
[0065]
对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.2g/cm3；压缩强度：0.41mpa(25％形变)。
[0066]
实施例5分泌表达产几丁质的泰山赤芝发酵工艺及其应用(普通碳氮源组合)
[0067]
与实施例1对比，将碳氮源配方改为氮源种类：酵母浸膏；碳源种类：葡萄糖，其余条件不变。
[0068]
对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.191g/cm3；压缩强度：0.32mpa。
[0069]
对材料内部的基质进行sem分析，与实施例1对比如图2所示，左图的固态基质表面
缠绕着密集生长密集的菌丝体(类似于蜘蛛丝包裹着秸秆等固态基质)，而右图由于未采用最优配方，表面的菌丝体较为稀疏，因此左图的高含量的菌丝材料表现出更高力学性能。
[0070]
实施例6分泌表达产几丁质的泰山赤芝发酵工艺及其应用(改变碳源种类)
[0071]
制备过程同实施例1，只更换了种子液中的碳源种类，其它条件不变。性能检测结果如下表1所示。
[0072]
表1不同碳源种类下材料性能检测结果
[0073][0074][0075]
实施例7分泌表达产几丁质的泰山赤芝发酵工艺及其应用(改变氮源种类)
[0076]
制备过程同实施例1，只更换了种子液中的氮源种类，其它条件不变。性能检测结果如下表2所示。
[0077]
表2不同氮源种类下材料性能检测结果
[0078]
氮源材料密度压缩性能酵母粉0.197g/cm30.34mpa酵母浸膏0.188g/cm30.34mpa氨基酸发酵废液0.183g/cm30.45mpa玉米浆0.193g/cm30.38mpa
[0079]
实施例8分泌表达产几丁质的泰山赤芝发酵工艺及其应用(改变秸秆粉粒径)
[0080]
制备过程同实施例1，只更换了种子液中的玉米秸秆粉粒径，其它条件不变。性能检测结果如下表3所示。
[0081]
玉米秸秆粉粒径材料密度压缩性能12目0.196g/cm30.33mpa60目0.194g/cm30.41mpa150目0.183g/cm30.45mpa200目0.181g/cm30.44mpa
[0082]
实施例9无诱导物实施例(与实施例1对比)
[0083]
制备过程同实施例1，只不添加诱导物秸秆粉，其它条件不变。对处理结束的材料进行性能检测，力学性能检测设备为万能试验机，检测的性能为压缩强度，检测标准参考国标《gb/t 8813—2020》；密度检测参考国标《gb/t 6343-2009》。性能检测结果：表观密度：0.185g/cm3；压缩强度：0.28mpa。
[0084]
如图3所示，为在种子液培养基中，不添加玉米秸秆粉、添加不同粒径的玉米秸秆粉作为几丁质诱导物时，种子液中菌球的红外对比图。其中红色为添加的诱导物为最优粒径的150目的玉米秸秆粉，绿色为添加的诱导物为粒径60目的玉米秸秆粉，蓝色为未添加诱
导物玉米秸秆粉，从图中用框线框出部分的1371cm-1
几丁质吸收峰可以看出，绿色与红色的吸收峰明显高于蓝色的吸收峰。
[0085]
本发明提供了一种分泌表达几丁质的食用菌发酵工艺及其在材料中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。