本发明涉及能够与vegfr2特异性结合的单域抗体(以下，其缩写为“抗vegfr2的单域抗体”)，以及含有该单域抗体作为有效成分的药物组合物，及其药物治疗用途。
背景技术：
1、vegf是一种分子量大小为40-45kda的促血管生成因子家族，英文全称vascularendothelial growth factors。vegf调节肿瘤的血管生成，主要通过和其受体(vegfr1、vegfr2和vegfr3)结合，从而激活细胞内信号通路，vegf及其受体(vegfr)在肿瘤的生长和转移中起关键性作用，可以通过阻断vegf-vegfr信号传导通路来控制肿瘤生长，达到治疗肿瘤的目的。抗vegf-vegfr药物大致包括以下几类：直接靶向vegf和vegfr蛋白的抗体药物，例如贝伐单抗和雷莫芦单抗；细胞内的酪氨酸激酶信号通路抑制剂，例如索拉菲尼等；另外还有融合蛋白以及免疫调节剂等类型的药物。
2、vegfr2(vascularendothelial growth factor receptor 2，血管内皮细胞生长因子受体2)是目前研究较为明确的vegf受体之一，其在血管生成、血管发育、血管通透性和胚胎造血的调节中起着至关重要的作用。vegf与vegfr2的结合会引发vegfr2形成受体二聚体并活化下游信号通路。vegfr2的胞外区由7个类ig亚基组成。此外，vegfr2还包括跨膜临膜结构域和催化酪氨酸激酶结构域。近年来以vegfr2为靶分子的抗肿瘤新药研发取得了很大进展，对于vegfr2通路来说，抑制配体的药物有单抗药物(贝伐单抗和雷珠单抗)、sirna药物哌加他尼和可溶性受体vegf-trap等。抑制受体胞内酪氨酸激酶的小分子药也较多，如索拉菲尼、舒尼替尼、反义rna、sirna等。
3、因此，制备能够特异性识别和结合vegfr2的抗体在对涉及vegfr2的疾病的诊断、治疗、预后等方面均具有重要意义。目前，现有技术中仍缺少亲和力强、具有药用价值的抗vegfr2的单域抗体产品。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种能够与vegfr2特异性结合的单域抗体及其用途。
2、本发明的第一方面提供了抗vegfr2的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括seq id no:29-seq id no:33任意一条所示的重链cdr1、seq id no:34-seq id no:37所示的重链cdr2和seq id no:38-seq id no:42任意一条所示的重链cdr3。
3、优选地，所述的重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的氨基酸序列为下述(1)-(5)的一种：
4、(1)seq id no:29所示的cdr1，seq id no:35所示的cdr2，seq id no:40所示的cdr3；
5、(2)seq id no:30所示的cdr1，seq id no:37所示的cdr2，seq id no:41所示的cdr3；
6、(3)seq id no:31所示的cdr1，seq id no:37所示的cdr2，seq id no:42所示的cdr3；
7、(4)seq id no:32所示的cdr1，seq id no:36所示的cdr2，seq id no:39所示的cdr3；
8、(5)seq id no:33所示的cdr1，seq id no:34所示的cdr2，seq id no:38所示的cdr3。
9、上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
10、在一个实施方案中，其中所述重链cdr1、cdr2和cdr3的任何一个或多个cdr中，一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其保守氨基酸取代。具体地，所述重链cdr1中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换；所述重链cdr2中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换；所述重链cdr3中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换。
11、如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
12、在一些实施例中，与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的cdr1、cdr2和cdr3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：asp、asn、glu、gln；(b)极性带正电残基：his、arg、lys；(c)芳香族残基：phe、trp、tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、gly、pro、met、leu、ile、val、cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：asp被glu取代；asn被gln或his取代；glu被asp取代；gln被asn取代；his被asn或gln取代；arg被lys取代；lys被arg、gln取代；phe被met、leu、tyr取代；trp被tyr取代；tyr被phe、trp取代；ala被gly或ser取代；ser被thr取代；thr被ser取代；gly被ala或pro取代；met被leu、tyr或ile取代；leu被ile或val取代；ile被leu或val取代；val被ile或leu取代；cys被ser取代。另外，本领域技术人员知晓，框架区序列fr1-4并非是不可改变的，fr1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
13、本发明中的“抗vegfr2的单域抗体”的含义，不仅包括完整的单域抗体，还包括所述抗vegfr2的单域抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”含义相同，均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与fc标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
14、在一个优选实施方案中，所述的重链还包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；框架区fr的氨基酸序列分别为：
15、seq id no:15-18任意一条所示的fr1或fr1的变体，所述fr1的变体在所述fr1中包含至多5个氨基酸的替换；
16、seq id no:19-21任意一条所示的fr2或fr2的变体，所述fr2的变体在所述fr2中包含至多5个氨基酸的替换；
17、seq id no:22-26任意一条所示的fr3或fr3的变体，所述fr3的变体在所述fr3中包含至多5个氨基酸的替换；
18、seq id no:27-28任意一条所示的fr4或fr4的变体，所述fr4的变体在所述fr4中包含至多5个氨基酸的替换。
19、本发明的第二方面是提供能结合vegfr2的单域抗体的氨基酸序列，所述单域抗体的氨基酸序列分别如seq id no：1-7所示，或者所述单域抗体与seq id no：1-7的氨基酸序列具有至少80％序列同源性，并且能够特异性结合vegfr2蛋白。
20、在一个实施方案中，所述抗vegfr2的单域抗体与选自seq id no：1-7或seq idno：1-7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合vegfr2蛋白。
21、本发明的第三个方面是提供前述任一的抗vegfr2的单域抗体的fc融合抗体或人源化抗体。
22、本发明的第四个方面是提供编码前述的抗vegfr2的单域抗体或前述的fc融合抗体或前述的人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如seq id no：8-14所示，或者与seq id no：8-14中的任意一条具有至少95％序列同源性。
23、在一个实施方案中，编码所述抗vegfr2的单域抗体的核酸分子选自seq id no：8-14或与选自seq id no：8-14的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且其编码的抗vegfr2的单域抗体能够特异性结合vegfr2蛋白。
24、本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码抗vegfr2的单域抗体或fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如seq id no：8-14所示或与seqid no：8-14中的任意一条具有至少80％序列同源性。
25、在一个优选的实施方案中，所使用的表达载体为rjk-v4-hfc1(通过基因工程手段将编码抗vegfr2的单域抗体或其fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子整合入rjk-v4-hfc1中)，根据需要还可以选择其他的通用型表达载体。
26、本发明的第六个方面是提供一种能够表达前述的抗vegfr2的单域抗体、fc融合抗体或人源化抗体的宿主细胞，或其包含前述的表达载体。优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
27、在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，包括细菌，真菌。
28、在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
29、在另一个优选的实施方案中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
30、在另一个优选的实施方案中，所述真核细胞选自下组：巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。
31、在另一个优选的实施方案中，所述真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
32、在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮expicho-s细胞。
33、在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮293f细胞。
34、本发明的第七个方面是提供一种重组蛋白，包含前述的抗vegfr2的单域抗体。所述的重组蛋白可以为前述的seq id no：1-7所示的单域抗体，也可以为与seq id no：1-7具有至少80％同源性的单域抗体，还可以是多表位抗体、多特异性抗体以及多价抗体；例如，所述的多表位抗体可由seq id no：1-7中的不止一条序列组成；所述的多价抗体可由seqid no：1-7中的其中一条序列重复排列若干次组成；所述的多特异性抗体包括但不限于双特异性抗体，以及三特异性抗体；此外，重组蛋白可以为前述的抗体的片段、衍生物和类似物。
35、本发明的第八个方面是提供一种药物组合物，其包含前述的结合vegfr2的单域抗体和药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常根据抗体的等电点确定(水性载体介质的ph需偏离该抗体的等电点，且与该抗体的等电点相差大约2)。
36、本发明的药物组合物可直接用于结合vegfr2蛋白分子。
37、本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的前述的单域抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。
38、本发明的第九个方面是提供一种用于治疗疾病的药剂，其包含前述的用于结合vegfr2蛋白的单域抗体作为活性成分。所述的疾病可以为肝癌、结直肠癌、胃肠道间质瘤、非小细胞肺癌、胃食管交界处腺癌、胃癌、食管癌、腺癌、胆道肿瘤、膀胱癌、胆管癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、高微卫星不稳定癌症、胰腺癌、类癌和实体瘤等疾病。
39、本发明的第十个方面是提供一种检测vegfr2水平的试剂盒，其含有前述的抗vegfr2的单域抗体。在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
40、在一个优选的实施方案中，该试剂盒包括识别vegfr2蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
41、在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。
42、在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的第二抗体可以为前述的抗vegfr2的单域抗体的抗体(作为抗抗体)，可以为单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的其它任意形式。
43、本发明的第十一个方面，提供了一种产生抗vegfr2的单域抗体的方法，包括步骤：
44、(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明的第六个方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗vegfr2的单域抗体的培养物；以及
45、(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗vegfr2的单域抗体；以及
46、(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗vegfr2的单域抗体。
47、本发明的第十二个方面是提供前述的抗vegfr2的单域抗体或前述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
48、在一个优选的实施方案中，所述的疾病可以为肝癌、结直肠癌、胃肠道间质瘤、非小细胞肺癌、胃食管交界处腺癌、胃癌、食管癌、腺癌、胆道肿瘤、膀胱癌、胆管癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、高微卫星不稳定癌症、胰腺癌、类癌和实体瘤等疾病。
49、有益效果
50、相对于现有技术，本发明的有益效果是：
51、(1)本发明的单域抗体特异性针对具有正确空间结构的vegfr2蛋白。
52、(2)本发明得到的单域抗体，表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。
53、(3)本发明得到的单域抗体，其抗体的多组合形式改造简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
54、(4)本发明得到的单域抗体，其亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nm级别至pm级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。