一种鱼骨总RNA的提取方法与流程

一种鱼骨总rna的提取方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼骨总rna的提取方法。


背景技术：

2.目前随着现代分子生物学技术研究的快速发展，对于基因组rna的研究已经成为目前研究热点方向之一，但是基因组rna与基因组dna分子结构性质不一样，基因组rna一级结构为一条单链结构，且不形成双螺旋结构，因此基因组rna的结构稳定性较差，极易发生降解现象，直接影响后续实验研究结果。
3.虽然在现代市场上有种类繁多的总rna提取试剂的试剂盒，据其说明书描述操作均能获得较好的效果，但是在人员实际操作过程中，因其受到实验样本的种类、实验操作环境、实验操作手法及实验室条件等诸多因素影响，往往很多实验结果未达到预期效果，特别是对于实验新手来讲更是一个极大的障碍。
4.为了获得更高质量的总rna就需要大量的重复实验或者委托第三方进行提取；此外，通常情况下基因组rna的提取实验环境需要在严格的无菌、无酶环境中进行实验，所用到的实验耗材也需要进行严格的无酶处理，在无形之中增加了实验的成本，因此，寻找一种新型高效、经济的总rna提取方法显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鱼骨总rna的提取方法，该方法是通过利用无菌的环境下，仅两次循环提取即可获得高质量总rna，解决了现有技术中多次重复试验方可达到的产品标准；同时也解决了现有技术中对于总rna提取实验环境的高要求的技术问题。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.一种鱼骨总rna的提取方法，包括：
8.s1、选取新鲜或冻存鱼骨组织在2-3min内破碎；
9.s2、在超净工作台上将破碎后的鱼骨组织置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加入总rna抽提试剂、振荡混匀、冰浴放置、离心并取上清液；
10.s3、在上清液中加入氯仿，振荡、冰浴、离心处理，获得自上而下的无色水样层、中间层和红色有机氯仿层组成的混合物；
11.s4、吸取s3中的无色水样层物质，加异丙醇混匀、冰浴放置、离心、弃上清液液后加入乙醇进行洗涤沉淀、冰浴放置、离心、弃上清液液；进行第二次乙醇洗涤沉淀、冰浴放置、离心、弃上清液液；室温放置、晾干后，加入无酶无菌水进行水浴处理后，立即进行冰浴处理，获得总rna。
12.上述发明提供了一种鱼骨总rna的提取方法，该方法中通过选用新鲜或是冷冻保存在-80℃的样本，并且要求在短时间内对鱼骨组织进行剪碎处理后速冻，目的是以降低细胞内rnase的活性及减少总rna的降解。
13.上述s2中，对于超净工作台进行灭菌处理以及进行操作时需要注意的是：开启超
净工作台，用浓度为75％乙醇溶液对超净工作台面进行消毒，将灭菌好的研钵、医用镊子、医用剪刀、普通离心管、无rnase或普通移液枪头、微量移液枪、乳胶手套，所需的试剂一同放入超净工作台中，关闭日光灯，开启紫外灯，进行紫外照射15min，通风5min方可使用。
14.上述s2中，在超净工作台上将破碎后的鱼骨组织置于研钵中，加液氮研磨成粉末的过程中，需要保证每个组织样品的研磨时间严格把握在3min以内，液氮研磨过程中必须保持研钵中常有液氮。
15.上述s2中，振荡混匀、冰浴放置的目的是，使得核蛋白体完全分离。
16.上述s3中，加入氯仿后，可以选用涡旋振荡15s或上下颠倒1.5min的方式进行振荡处理。
17.上述s4中，利用两次乙醇洗涤沉淀的目的是，去除蛋白，脂类和其它杂质分子，提高rna的得率和纯度。
18.上述s4中，加入无酶无菌水进行水浴处理的目的是，为了充分溶解rna；立即进行冰浴处理且冰浴时间极短、同时要求保存环境，是为了防止提取获得的总rna降解。
19.作为优选地，所述冻存鱼骨组织为在-80℃进行保存。
20.作为优选地，所述s2中，加液氮研磨的时间不超过3min。
21.作为优选地，所述s2中，破碎后的鱼骨组织与总rna抽提试剂的用量比为30-60mg：1ml。
22.作为优选地，所述s2中，采用在2000-2700r/min振荡混匀、在冰浴条件下放置5-10min；在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心8-10min，并取上清液；
23.所述冰浴条件为0℃。
24.作为优选地，所述s3中，氯仿与总rna抽提试剂的用量比为0.2-0.22ml：1ml。
25.上述利用氯仿的目的是，抽离蛋白，使有机相和无机相迅速分离，加速有机相和水相分层。
26.作为优选地，所述s3中，采用在15s-1.5min振荡处理、在冰浴条件下放置2-2.5min，在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心10-15min；所述冰浴条件为0℃。
27.作为优选地，所述s4中，异丙醇与总rna抽提试剂的用量比为300-600μl：0.5-1ml；上述在冰浴条件下放置20-30min；4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心10-15min，弃上清液；所述冰浴条件为0℃。
28.上述利用异丙醇的目的是为了沉淀rna。
29.作为优选地，所述s4中，加入1.2-1.5ml 75％的乙醇洗涤沉淀、在冰浴条件下放置3-5min；4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心2-3min，弃上清液；所述冰浴条件为0℃。
30.作为优选地，所述s4中，室温放置2-3min，晾干、加入30-100μl无酶无菌水，在55-60℃水浴2-3min，立即冰浴1-2min，得到的总rna溶液，并保存至-70℃；所述冰浴条件为0℃。
31.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
32.本发明提供了一种鱼骨总rna的提取方法，该方法适用于鱼骨组织样品，其提取效率高效、方便快速、减少去rnase离心管及移液枪头的消耗量，试剂较为廉价常见，有效的减低经济成本，也减少了实验耗材去rnase的处理步骤，对于实验环境条件较差或实验新手而言及其重要。
33.该方法中通过选用新鲜或是冷冻保存在-80℃的样本，并且要求在短时间内对鱼骨组织进行剪碎处理后速冻，目的是以降低细胞内rnase的活性及减少总rna的降解。在超净工作台上将破碎后的鱼骨组织置于研钵中，加液氮研磨成粉末的过程中，需要保证每个组织样品的研磨时间严格把握在3min以内，液氮研磨过程中必须保持研钵中常有液氮。振荡混匀、冰浴放置的目的是，使得核蛋白体完全分离。利用两次乙醇洗涤沉淀的目的是去除蛋白，脂类和其它杂质分子。提高rna的得率和纯度。加入无酶无菌水进行水浴处理的目的是，为了充分溶解rna；立即进行冰浴处理且冰浴时间极短、同时要求保存环境，是为了防止提取获得的总rna降解。
附图说明
34.图1为本发明实施例的一种具体实施方式的的工艺流程示意图；
35.图2为本发明实施例1的凝胶电泳示意图。
具体实施方式
36.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.本发明的一种具体实施方式的技术方案为：
38.一种鱼骨总rna的提取方法，该方法包括如下步骤：
39.1)样本预处理：在适宜的环境中采集获取新鲜或-80℃冻存的鱼骨组织，严格控制把握鱼骨组织暴露在外界环境的时间2-3min以内，将鱼骨组织尽量剪碎装入离心管内，立即将装有鱼骨组织样品的离心管浸入液氮中进行降温速冻。目的以降低细胞内rnase的活性及减少总rna的降解；冷冻保存样品温度应在-80℃下保存。
40.2)开启超净工作台，用浓度为75％乙醇溶液对超净工作台面进行消毒，将灭菌好的研钵、医用镊子、医用剪刀、普通离心管、无rnase或普通移液枪头、微量移液枪、乳胶手套，所需的试剂一同放入超净工作台中，关闭日光灯，开启紫外灯，进行紫外照射15min，通风5min。
41.3)取30-60mg冷冻保存的鱼骨组织于研钵中，加入液氮进行充分研磨至组织粉末。注意：每个组织样品的研磨时间严格把握在3min以内，液氮研磨过程中必须保持研钵中常有液氮。
42.4)向装有液氮研磨好30-60mg的鱼骨组织样本粉末离心管中加入1ml trizolplus，在2000-2700r/min振荡充分混匀，在冰浴条件下放置5-10min使得核蛋白体完全分离；
43.5)在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心8-10min，取上清；
44.6)每1ml trizolplus加入0.2-0.22ml氯仿。盖紧管盖，涡旋振荡15s或上下颠倒1.5min，在冰浴条件下放置2-2.5min，在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心10-15min；
45.7)离心完成后的混合物分成三层：下层红色有机氯仿层，中间层，上层无色的水样
层。吸取上层无色的水样层物质至干净的离心管中；
46.8)加入600μl异丙醇，上下颠倒混匀，在冰浴条件下放置20-30min；
47.9)在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心10-15min，弃上清液；
48.10)加入1.2ml质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下放置3min；
49.11)在4-5℃的条件下以11000-12000r/min离心3-5min，弃上清液，注意不要丢失rna沉淀；
50.12)重复采用1.2ml质量百分比75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下放置3-5min，4℃、12000r/min离心10min、弃上清液；
51.13)室温放置2-3min，晾干。加入30-100μl无酶无菌水(rnase free water)55-60℃水浴2-3min，充分溶解rna，立即0℃冰浴2min，瞬离，得到的rna溶液保存至-70℃，防止降解。
52.上述选用的trizolplus，为一种新型的总rna抽提试剂，该产品来自于：厂商genenode；货号：2101b。
53.实施例1：提取流程如图1所示
54.一种鱼骨总rna的提取方法，该方法包括如下步骤：
55.1)样本预处理：在适宜的环境中采集获取新鲜或-80℃冻存的鱼骨组织，严格控制把握鱼骨组织暴露在外界环境的时间2-3min以内，将鱼骨组织尽量剪碎装入离心管内，立即将装有鱼骨组织样品的离心管浸入液氮中进行降温速冻。
56.2)开启超净工作台，用浓度为75％乙醇溶液对超净工作台面进行消毒，将灭菌好的研钵、医用镊子、医用剪刀、普通离心管、无rnase或普通移液枪头、微量移液枪、乳胶手套，所需的试剂一同放入超净工作台中，关闭日光灯，开启紫外灯，进行紫外照射15min，通风5min。
57.3)取30-60mg冷冻保存的鱼骨组织于研钵中，加入液氮进行充分研磨至组织粉末。注意：每个组织样品的研磨时间严格把握在3min以内，液氮研磨过程中必须保持研钵中常有液氮。
58.4)向装有液氮研磨好30-60mg的鱼骨组织样本粉末离心管中加入1mltrizolplus，在2000-2700r/min振荡充分混匀，在冰浴条件下放置5min使得核蛋白体完全分离；
59.5)在4℃的条件下以12000r/min离心10min，取上清；
60.6)每1ml trizolplus加入0.22ml氯仿。盖紧管盖，涡旋振荡15s或上下颠倒1.5min，在冰浴条件下放置2.5min，在4℃的条件下以12000r/min离心10-15min；
61.7)离心完成后的混合物分成三层：下层红色有机氯仿层，中间层，上层无色的水样层。吸取上层无色的水样层物质至干净的离心管中；
62.8)加入600μl异丙醇，上下颠倒混匀，在冰浴条件下放置20-30min；
63.9)在4℃的条件下以12000r/min离心10-15min，弃上清液；
64.10)加入1.2ml质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下放置3min；
65.11)在4℃的条件下以12000r/min离心3min，弃上清液，注意不要丢失rna沉淀；
66.12)重复采用1.2ml质量百分比75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下
放置3min，4℃、12000r/min离心10min、弃上清液；
67.13)室温放置3min，晾干。加入30-100μl无酶无菌水(rnase free water)55-60℃水浴2min，充分溶解rna，立即0℃冰浴2min，瞬离，得到的rna溶液保存至-70℃，防止降解。
68.实施例2：提取流程如图1所示
69.一种鱼骨总rna的提取方法，该方法包括如下步骤：
70.1)样本预处理：在适宜的环境中采集获取新鲜或-80℃冻存的鱼骨组织，严格控制把握鱼骨组织暴露在外界环境的时间2-3min以内，将鱼骨组织尽量剪碎装入离心管内，立即将装有鱼骨组织样品的离心管浸入液氮中进行降温速冻。冷冻保存样品温度应在-80℃下保存。
71.2)开启超净工作台，用浓度为75％乙醇溶液对超净工作台面进行消毒，将灭菌好的研钵、医用镊子、医用剪刀、普通离心管、无rnase或普通移液枪头、微量移液枪、乳胶手套，所需的试剂一同放入超净工作台中，关闭日光灯，开启紫外灯，进行紫外照射15min，通风5min。
72.3)取30-60mg冷冻保存的鱼骨组织于研钵中，加入液氮进行充分研磨至组织粉末。注意：每个组织样品的研磨时间严格把握在3min以内，液氮研磨过程中必须保持研钵中常有液氮。
73.4)向装有液氮研磨好30-60mg的鱼骨组织样本粉末离心管中加入1ml trizolplus，在2000-2700r/min振荡充分混匀，在冰浴条件下放置5-10min使得核蛋白体完全分离；
74.5)在4℃的条件下以12000r/min离心8min，取上清；
75.6)每1ml trizolplus加入0.22ml氯仿。盖紧管盖，涡旋振荡15s或上下颠倒1.5min，在冰浴条件下放置2.5min，在4℃的条件下以12000r/min离心10-15min；
76.7)离心完成后的混合物分成三层：下层红色有机氯仿层，中间层，上层无色的水样层。吸取无色的水样层物质至干净的离心管中；
77.8)加入600μl异丙醇，上下颠倒混匀，在冰浴条件下放置20-30min；
78.9)在4℃的条件下以12000r/min离心15min，弃上清液；
79.10)加入1.2ml质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下放置3min；
80.11)在4℃的条件下以12000r/min离心5min，弃上清液，注意不要丢失rna沉淀；
81.12)重复采用1.2ml质量百分比75％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒洗涤，在冰浴条件下放置5min，4℃、12000r/min离心10min、弃上清液；
82.13)室温放置3min，晾干。加入30-100μl无酶无菌水(rnase free water)55-60℃水浴3min，充分溶解rna，立即冰浴2min，瞬离，得到的rna溶液保存至-70℃，防止降解。
83.实验例：
84.以实施例1作为实验例进行凝胶电泳法验证，结果表明：
85.如图2所示，第1条与第8条为两个100-5000bp的maker条带，剩余6条带为提取的rna条带。
86.图中第2-7中，从上至下，分别是第一，二，三层的rna条带28s，18s，5s清晰无降解，无蛋白污染，rna完整性较好，提取质量高。
87.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。