降低蓝莓果采后腐烂率的生防菌的筛选方法

1.本发明涉及生防菌的筛选方法，具体地，涉及一种降低蓝莓果采后腐烂率的生防菌的筛选方法。


背景技术：

2.蓝莓(vaccinium spp.)为杜鹃花科越橘属灌木果树。蓝莓果实被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。各国根据自己的气候特点和资源优势开展了具有本国特色的蓝莓栽培与育种工作。一些发达国家已把普及蓝莓列为全民健康保障的一种措施，所以蓝莓的社会需求量迅速增长，产量缺口与日俱增。在我国长江以南的低山丘陵地区，兔眼蓝莓和南高丛蓝莓的部分品种的适应性较好，品质较优。蓝莓果实成熟于高温多雨的季节，由于采后田间热和呼吸热较高，果实的各种生理代谢活动加快，采后果实易失水，硬度降低迅速，果肉变软，蒂痕部易腐烂霉变。果蔬采后病害可导致其营养物质遭到破坏，病原菌的繁殖不仅能使果蔬产生异味，而且能引起食源性疾病。
3.我国南方栽培的南高丛蓝莓成熟期正值高温多雨季节，使用生防菌产生的具有拮抗活性的物质有利于抑制果实采后病原菌，进而提高蓝莓果实的耐贮性。因此，源于浆果蓝莓果实采后贮运等生产实际的迫切需求。蓝莓浆果极易遭到病原菌的侵染问题，筛选出最有利于抑制果实采后病原菌的生防菌，达到提高果实贮藏性能的作用是亟不可待的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种降低蓝莓果采后腐烂率的生防菌的筛选方法，该筛选方法操作简单，试剂成本低，高效且成功率高，可以筛选出最有利于抑制蓝莓果实采后病原菌的生防菌，有助于提高蓝莓果实的耐贮性，为蓝莓果实采后贮运降低成本和提高经济效益提供了一种新途径。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种降低蓝莓果实采后腐烂率的生防菌的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
6.(1)生防菌菌源的获取与鉴定：从腐烂的农作物中筛选出至少一种生防菌，纯化后测序鉴定菌种；
7.(2)生防菌菌液的制备：将步骤(1)所述各生防菌菌源进行活化，再将已活化的各生防菌的菌源接种到lb液体培养基中培养，即获得各生防菌菌种的菌液；
8.(3)生防菌的接种处理：将蓝莓果实分成对照组和实验组，分别用超纯水及步骤(2)上述制备好的生防菌菌液浸泡后捞出沥干；
9.(4)低温处理与指标测定：将步骤(3)沥干后的蓝莓果实放置在2-6℃下贮藏，每隔4-6天进行取样分析相关指标，连续取样至少5次；
10.(5)相关指标的计算：根据取样分析结果计算腐烂率、失重率、花青苷含量、可溶性固形物、vc含量、丙二醛含量、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，筛选出效果最好的生防菌。
11.通过前述技术方案，本发明具有如下有益效果：
12.本发明的筛选方法操作简单，试剂成本低，高效且成功率高，可以筛选出最有利于抑制蓝莓果实采后病原菌的生防菌，有助于提高蓝莓果实的耐贮性，为蓝莓果实采后贮运降低成本和提高经济效益提供了一种新途径。
13.本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
14.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
15.图1不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下腐烂率的影响；
16.图2不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下失重率的影响；
17.图3不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下花青苷含量的影响；
18.图4不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下tss(可溶性固形物)含量的影响；
19.图5不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下vc含量的影响；
20.图6不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下mda(丙二醛)含量的影响；
21.图7不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下pod活性的影响；
22.图8不同芽孢杆菌对“奥尼尔”蓝莓果实在4℃贮藏条件下sod活性的影响。
具体实施方式
23.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
24.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
25.本发明提供了一种降低蓝莓果实采后腐烂率的生防菌的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
26.(1)生防菌菌源的获取与鉴定：从腐烂的农作物中筛选出至少一种生防菌，纯化后测序鉴定菌种；
27.(2)生防菌菌液的制备：将步骤(1)上述各生防菌菌源进行活化，再将已活化的各生防菌的菌源接种到lb液体培养基中培养，即获得各生防菌菌种的菌液；
28.(3)生防菌的接种处理：将蓝莓果实分成对照组和实验组，分别用超纯水及步骤(2)所述制备好的生防菌菌液浸泡后捞出沥干；
29.(4)低温处理与指标测定：将步骤(3)沥干后的蓝莓果实放置在2-6℃下贮藏，每隔4-6天进行取样分析相关指标，连续取样至少5次；
30.(5)相关指标的计算：根据取样分析结果计算腐烂率、失重率、花青苷含量、可溶性固形物、vc含量、丙二醛含量、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，筛选出效果最好的
生防菌。
31.在上述筛选方法中，生防菌的菌种可以在宽的范围内选择，为了使筛选的生防菌菌种有更好的防腐能力，优选地，步骤(1)中所述农作物选自蓝莓、梨和水稻中的至少一者。
32.在上述筛选方法中，生防菌的菌种可以在宽的范围内选择，但是为了使筛选的生防菌菌种有更好的防腐能力，优选地，步骤(1)中所述生防菌均为芽孢杆菌，选自枯草芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌a，蜡样芽孢杆菌b，高山芽孢杆菌，萎缩芽孢杆菌和热带芽孢杆菌中的至少一者。
33.在上述筛选方法中，为了保证生防菌菌种生长环境良好，优选地，步骤(2)中lb液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠。
34.在上述筛选方法中，为了保证生防菌菌种生长不受限，优选地，步骤(2)中所述的已活化的各生防菌的菌源与lb液体培养基的体积比为1:1
×
10
3-2
×
103。
35.在上述筛选方法中，为了保证生防菌的菌种的长势，优选地，步骤(2)中所述培养的条件包括：温度为35-40℃，转速为130-140r/min，培养时间为8-12h。
36.在上述筛选方法中，蓝莓果实的品种可以在宽的范围内选择，但是为了考虑到实验的经济效益，优选地，步骤(3)中所述蓝莓果实的品种为“奥尼尔”。
37.在上述筛选方法中，浸泡时间可以在宽的范围内选择，但是为了使生防菌的防腐效果达到最佳，优选地，步骤(3)中所述浸泡时间为1-5min。
38.在上述筛选方法中，为了保证生防菌的防腐效果，优选地，步骤(3)中所述蓝莓果实在采收后首先预冷，预冷温度为18-24℃，预冷时间为1.5-3h。
39.在上述筛选方法中，为了使生防菌的防腐效果达到最优，优选地，步骤(3)中所述蓝莓果实选取无果柄、无机械损伤、大小及成熟度相对一致、色泽均一的果实。
40.本发明通过从腐烂的蓝莓、梨和水稻中筛选出6种生防菌，经鉴定6种生防菌均为芽孢杆菌，分别为枯草芽孢杆菌(bacillus subtulis)；蜡样芽孢杆菌a(bacillus cereus)；蜡样芽孢杆菌b(bacillus cereus)；高山芽孢杆菌(bacillus altitudinis)；萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)；热带芽孢杆菌(bacillus trolicus)，然后将上述生防菌在lb液体培养基中进行增倍培养，lb液体培养基中的酵母提取物为微生物提供碳源、能源、磷酸盐、生长因子、维生素等；胰蛋白胨主要提供氮源；nacl主要提供微生物生长环境(如渗透压)，其次是提供无机盐，可以使筛选出的生防菌可以实现好的增倍，以供后续实验的使用。将得到的生防菌接种于采后的蓝莓果实上，筛选出最有利于抑制果实采后病原菌的生防菌，进而提高蓝莓果实的耐贮性。
41.以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，所述生防菌菌种由腐烂蓝莓、梨以及水稻中分离鉴定出来，由本团队提供；所述蓝莓采用南高丛蓝莓品种“奥尼尔”，采自安徽省南陵县藉山镇林场(安徽徽王农业有限公司蓝莓基地)；所述药品和药剂均为常规市售品。
42.实施例
43.(1)从腐烂的蓝莓、梨和水稻中筛选出6种生防菌，纯化后测序鉴定菌种，经鉴定6种生防菌均为芽孢杆菌，分别为枯草芽孢杆菌(b1)；蜡样芽孢杆菌a(b2)；蜡样芽孢杆菌b(b3)；高山芽孢杆菌(b4)；萎缩芽孢杆菌(b5)；热带芽孢杆菌(b6)；
44.(2)取500μl已活化的芽孢杆菌b1-b6菌源加入500ml lb液体培养基(1％胰蛋白
胨、0.5％酵母浸出物、1％无机盐)中，在37℃，135r/min的条件下振荡培养10h，制成菌液备用。
45.(3)将已成熟的“奥尼尔”蓝莓果实采收后放置在预冷室(21℃)预冷2h，之后放置内置冰袋的泡沫盒内运回实验室。选取无果柄、无机械损伤、大小及成熟度相对一致、色泽均一的果实并装入低密度聚乙烯塑料食品包装盒备用，果实数约2800颗；
46.(4)将预冷后的蓝莓果实随机放入规格为109mm
×
109mm
×
42mm(长
×
宽
×
高)的低密度聚乙烯塑料食品包装盒内120颗/盒，将其平分为7组，分别用超纯水及b1-b6对应的生防菌菌液浸泡3min后捞出沥干。
47.ck：对照组，超纯水处理；b1：枯草芽孢杆菌处理；b2：蜡样芽孢杆菌处理a；b3：蜡样芽孢杆菌处理b；b4：高山芽孢杆菌处理；b5：萎缩芽孢杆菌处理；b6：热带芽孢杆菌处理。
48.(5)将上述处理后的7组果实均放置于4℃冷藏条件下贮藏，贮藏期间每隔5d取样分析，连续取样5次。
49.检测例
50.对上述得到的b1-b6和ck进行相关指标测定，测定项目和标准如下：
51.腐烂率以果实表面出现明显的破溃流汁或腐烂为准，腐烂率(％)＝(腐烂果数/总果数)
×
100％；
52.失重率(％)＝(原始单果重量-贮藏后单果重量)/原始单果重量
×
100％；
53.可溶性固形物采用数显糖度计测定；
54.可滴定酸采取酸碱滴定法；
55.花青素含量采取甲醇提取比色法测定(曹建康，2007)；
56.维生素c采用2,4-二硝基苯肼比色法测定(以鲜质量计)(gb/t，2003)；
57.丙二醛(mda)采用硫代巴比妥酸比色法(mda是植物组织衰老时发生膜脂过氧化的中间产物，常被作为衡量膜脂过氧化程度的指标，用以反映细胞膜透性及果实衰老的程度)；
58.过氧化物酶(pod)和超氧化物歧化酶(sod)活性(李合生，2003)，
59.得到的结果如图1-8所示。
60.如图1所示，与对照组ck相比，实验组b1-b6显著抑制了“奥尼尔”蓝莓果实的腐烂率(p《0.05)，尤其以b4延缓“奥尼尔”蓝莓果实腐烂率下降最为明显。在第25d时，7个分组的腐烂率从低到高依次为：b4《b6《b1《b2《b3《b5《ck，由此可以看出b4的高山芽孢杆菌抑制蓝莓贮藏腐烂率效果最佳，ck的腐烂率已高达49.7％，b4的只有13.03％。
61.如图2所示，与对照组ck相比，实验组b1，b2，b3，b4，b6显著抑制了“奥尼尔”蓝莓果实的失重率(p《0.05)，尤其是b4高山芽孢杆菌延缓“奥尼尔”蓝莓果实失重率下降最为明显，b5并没有显著抑制蓝莓果实的失重率。在第25d时，7个分组的腐烂率从低到高依次为：b4《b6《b1《b2《b3《b5《ck，由此可以看出b4的高山芽孢杆菌在蓝莓贮藏期延缓失重率效果最佳；ck的失重率已达到37.63％，b4失重率只有22.89％如图3所示，在4℃贮藏条件下，“奥尼尔”蓝莓果实的花青苷含量随贮藏期的延长呈下降趋势。实验组b1-b6生防菌菌液的处理对“奥尼尔”蓝莓果实花青素含量的降低有明显的延缓作用，如贮藏前期，0-5d，b4高山芽孢杆菌延缓蓝莓果实花青苷含量下降最为明显。第25d时，实验组b1-b6与对照组ck之间有显著差异，但是实验组b1-b6之间并无明显差异(p《0.05)。
62.由图4可知，在4℃贮藏条件下，“奥尼尔”蓝莓果实的可溶性固形物(tss)含量随贮藏期的延长呈下降趋势；实验组b1-b6生防菌菌液处理均能延缓tss含量的下降，尤其是b4高山芽孢杆菌处理的蓝莓果实效果最为明显，与腐烂率和失重率结果一致，在贮藏后期，第25d时，其延缓蓝莓果实的可溶性固形物含量下降效果依次为：b4》b6》b1》b2》b3》b5》ck。
63.如图5所示，在4℃贮藏条件下，“奥尼尔”蓝莓果实的vc含量均随着贮藏时间的延长而下降，实验组b1-b6生防菌菌液处理延缓了蓝莓果实vc含量下降，贮藏至25d时，与对照组ck相比，实验组b1-b6明显延缓了蓝莓果实的vc含量的下降，其中以b4高山芽孢杆菌的延缓下降效果最佳，但是实验组b1-b6之间并无明显差异(p《0.05)。
64.如图6所示，在4℃贮藏条件下，“奥尼尔”蓝莓果实的mda含量均呈先升高后降低的变化趋势，其峰值均出现在20d。实验组b1-b6生防菌菌液处理的“奥尼尔”蓝莓果实mda含量变化均缓于对照组ck，其中以b4高山芽孢杆菌菌液处理过的蓝莓果实的峰值最低，mda含量显著低于其余实施例，其抑制mda含量增加。由此可见b4高山芽孢杆菌的效果最佳，其蓝莓果实的mda含量的变幅最小。
65.由图7可知，在贮藏期间各实施例蓝莓果实的pod活性均呈先升后降的变化趋势，“奥尼尔”蓝莓果实在第20d达到高峰。在贮藏后期，b4高山芽孢杆菌菌液处理的“奥尼尔”蓝莓果实的pod活性均显著高于其他实验组(p《0.05)。在第25d时，b5与对照组ck之间并无显著差异，其余实验组与对照组之间有显著延缓pod酶活下降的效果，但是实验组b1-b6之间并无明显差异(p《0.05)。
66.由图8可知，蓝莓果实sod活性变化与pod酶活变化相似，均呈现先升高后下降趋势，sod峰值均出现在第20d，而实验组b1-b6生防菌菌液处理的蓝莓果实的sod活性峰值均高于对照组ck(p《0.05)。在贮藏后期，sod活性由小到大的顺序为：b6《ck《b5《b1《b2《b3《b4。
67.上述结果表明，4℃冷藏条件下，本发明中涉及的6种不同的芽孢杆菌可以有效降低“奥尼尔”蓝莓果实的腐烂率且延缓了其蓝莓果实的失重，延缓蓝莓果实tss、vc、花青苷等含量的下降，抑制其mda累积。综合多个果实品质指标的变化及其抗氧化指标，其中高山芽孢杆菌对延长南高丛蓝莓“奥尼尔”果实贮藏保质期的效果最好，蜡样芽孢杆菌a和蜡样芽孢杆菌b效果次之，而萎缩芽孢杆菌效果最不理想。
68.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
69.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
70.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。