一种醋酸菌及其发酵产物和应用的制作方法

acetylbutyrate)、柠檬酸(citric acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、3-dehydrosphinganine、n-乙酰-亮氨酸(n-acetylleucine)、l-木酮糖(l-threo-2-pentulose)及6-羟基己酸(6-hydroxyhexanoic acid)。
11.本发明的另一目的，在于提供所述的一种醋酸菌发酵产物在制备美白化妆品中的应用：
12.本发明的另一目的，在于提供一种醋酸菌发酵产物的制备方法，其由所述的醋酸菌在gy液体培养基上发酵而得，所述的gy液体培养基中包括重量比4-6％葡萄糖和0.4-1.0％酵母提取粉。
13.进一步地，醋酸菌的接种量为10
6-108cfu/ml。进一步地，发酵时间为3-6天，温度为25-37℃。
14.本发明的菌株，具有生产多种有机酸能力，发酵产物具有良好的抗氧化以及抑制酪氨酸酶活力。
附图说明
15.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
16.图1、自雪莲菌筛选出来的菌株，基于16s rrna序列构建的系统发育树。
17.图2、不同浓度的醋酸菌发酵物对raw264.7细胞(a)及b16-f10细胞(b)活性的影响。control为没有经过发酵的培养基萃取物。3d为经过醋酸菌发酵后3天的萃取物。6d为经过醋酸菌发酵后6天的萃取物。
18.图3、不同浓度的醋酸菌发酵物清除dpph自由基的分析。control为没有经过发酵的培养基萃取物。3d为经过醋酸菌发酵后3天的萃取物。6d为经过醋酸菌发酵后6天的萃取物。
19.图4、不同浓度的醋酸菌发酵物抑制酪氨酸酶的分析。control为没有经过发酵的培养基萃取物。3d为经过醋酸菌发酵后3天的萃取物。6d为经过醋酸菌发酵后6天的萃取物。
20.图5、第3天及第6天醋酸菌发酵物中相对含量较多10个成分的ms/ms图谱分析。从a至j分别是琥珀酸(succinic acid)、哌啶酸(pipecolic acid)、iminoarginine、4-乙酰基丁酸乙酯(4-acetylbutyrate)、柠檬酸(citric acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、3-dehydrosphinganine、n-乙酰-亮氨酸(n-acetylleucine)、l-木酮糖(l-threo-2-pentulose)及6-羟基己酸(6-hydroxyhexanoic acid)。
21.图6、不同有机酸抑制酪氨酸酶的分析，包含琥珀酸(a)、柠檬酸(b)及dl-2-哌啶酸(c)。
具体实施方式
22.实施例1菌株分离及鉴定
23.市购的雪莲菌经纯牛奶发酵培养后利用平板划线法分离，37℃培养2天，用接种环刮取平板上的菌株，于gy液体培养基(glucose yeast extract，为5％葡萄糖、0.5％酵母提取粉。制备方法：称取所需重量的葡萄糖和酵母提取粉，加蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌20min)中培养。将挑选的菌株利用16s rrna引物(f27-agagtttgatcmtggctcag；r1492-tacggytaccttgttacgactt)进行16s rrna基因扩增。pcr條件為94℃，5分钟；94℃，30秒；55
℃，30秒；72℃，1.5分钟；72℃，7分钟。将扩增后的dna序列送至金唯智(广州)生物科技有限公司进行dna测序，再利用mega软件构建基于16s rdna基因序列分析系统发育树。见图1。
24.获得的一株，根据ncbi数据库比对分析，发现此菌株属于醋酸菌，命名为acetobacter sp.xm-1(图1)。此菌株于2022年06月27日，保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，编号为cctcc m 2022983。
25.实施例2醋酸菌发酵物的制备
26.将醋酸菌活化后，将活化的菌株以体积比1：100接种于gy液体培养基(醋酸菌的接种量约为10
6-107cfu/ml)；在37℃下摇瓶培养3天及6天，获得的发酵液利用乙酸乙酯进行萃取，萃取液以旋转蒸发仪去除乙酸乙酯，再进行冷冻干燥获得萃取物。
27.实施例3细胞毒性分析
28.利用mtt检测进行安全评估。于37℃及5％co2培养箱中进行巨噬细胞(raw 264.7)及小鼠黑色素瘤细胞(b16-f10)培养24小时，加入不同浓度发酵萃取物，培养24小时后，加入6μl的mtt(3％)溶液反应，于37℃及5％co2反应4小时后移除培养液，加入200μl的dmso溶解沉淀物，以酶标仪分析490nm吸光值。
29.实施例4抗氧化分析
30.配制0.25mm dpph的溶液。取20μl不同浓度的醋酸菌发酵萃取物，加入180μl dpph溶液，震荡混合，并于室温静置反应。使用酶标仪分析517nm吸光值。计算清除率(％)＝[控制组于517nm吸光值-样品反应后于517nm吸光值/控制组于517nm吸光值]*100。
[0031]
实施例5抑制酪氨酸酶分析
[0032]
将不同浓度的醋酸菌发酵萃取物添加到96孔板中，取100μl蘑菇酪氨酸酶(400u/ml)及l-dopa(10mm)加入混合物中，将其在室温下静置反应。用酶标仪在od475检测吸光度。酪氨酸酶的抑制作用计算如下：蘑菇酪氨酸酶活性的相对抑制率(％)＝[控制组于475nm吸光值-样品反应后于475nm吸光值/控制组于475nm吸光值]*100。
[0033]
实施例6醋酸菌发酵物中化合物的分析
[0034]
发酵萃取物的分析为委托苏州金唯智生物科技有限公司进行定性及定量检测，实验流程如下。取600μl甲醇甲醇(含2-氯-l-苯丙氨酸(4ppm))加入发酵萃取物中，以组织研磨仪研磨及室温超声15分钟，经离心过滤后，取过滤液进行lc/ms的检测，色谱柱采用acquityhss t3色谱柱(2.1
×
150mm，1.8μm，美国waters公司)，正离子模式，流动相为0.1％甲酸乙腈(c)和0.1％甲酸水(d)，梯度洗脱程序为：0～1min，2％c；1～9min，2％～50％c；9～12min，50％～98％c；12～13.5min，98％c；13.5～14min，98％～2％c；14～20min，2％c。负离子模式，流动相为乙腈(a)和5mm甲酸铵水(b)，梯度洗脱程序为：0～1min，2％a；1～9min，2％～50％a；9～12min，50％～98％a；12～13.5min，98％a；13.5～14min，98％～2％a；14～17min，2％a。流速为0.25ml/min。质谱采用电喷雾电离(esi)源，正离子喷雾电压为3.50kv，负离子喷雾电压为-2.50kv，鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率60000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100～1000，并采用hcd进行二级裂解，碰撞电压为30％，二级分辨率为15000，采集信号前4离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的ms/ms信息。
[0035]
表1、第3天及第6天醋酸菌发酵物中相对含量较多的前10个成分。
[0036][0037]
a第3天及第6天醋酸菌发酵物与没有经过发酵的培养基萃取物比例。
[0038]
2.本发明第3天及第6天的发酵产物，在浓度为1.25mg/ml的条件下，对巨噬细胞(raw264.7)及小鼠黑色素瘤细胞(b16-f10)的存活率仍然有100％，显示此发酵物对巨噬细胞及小鼠黑色素瘤细胞不具有毒性影响(图2)。当浓度提高到2.5mg/ml时，对小鼠黑色素瘤细胞仍不受影响，但对巨噬细胞則有影响。没有经过醋酸菌发酵的萃取物，对细胞的影响性则更大。
[0039]
3.本发明第3天及第6天的发酵产物，在浓度为2.5mg/ml的条件下，分别具有40％及36％去除dpph自由基的能力，当浓度为1.25mg/ml的条件下，则具有28％及21％去除dpph自由基的能力。相对于没有经过发酵的培养基萃取物，显示有较好的抗氧化能力(图3)。
[0040]
4.本发明第3天的发酵产物，在浓度为5mg/ml的条件下具有90％抑制酪氨酸酶的能力。在浓度为1.25mg/ml的条件下，仍具有86％以上的酪氨酸酶抑制能力。本发明第6天的发酵产物，在浓度为5mg/ml的条件下超过90％抑制酪氨酸酶的能力。在浓度为1.25mg/ml的条件下则有73％抑制酪氨酸酶的能力(图4)。没有经过发酵的培养基萃取物，在浓度为5mg/ml的条件下，则只有21％抑制酪氨酸酶的能力。
[0041]
5.本发明利用lc-ms分析醋酸菌发酵物中的代谢物成分(表1)，发现相对于没有经过发酵的培养基萃取物，发酵物中含量较多的10个成分分别是琥珀酸(succinic acid)、哌啶酸(pipecolic acid)、iminoarginine、4-乙酰基丁酸乙酯(4-acetylbutyrate)、柠檬酸(citric acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、3-dehydrosphinganine、n-乙酰-亮氨酸(n-acetylleucine)、l-木酮糖(l-threo-2-pentulose)及6-羟基己酸(6-hydroxyhexanoic acid)，图5。
[0042]
6.进一步分析含量比例较高的有机酸抑制酪氨酸酶的能力，0.5mg/ml的琥珀酸(succinic acid)、dl-2-哌啶酸(pipecolic acid)及柠檬酸(citric acid)对酪氨酸酶活性的抑制率分别是43％、18％、57％，而1mg/ml的葡萄糖酸钙(gluconic acid calcium salt)有微弱的抑制酪氨酸酶活性的能力。琥珀酸及柠檬酸在抑制酪氨酸酶的表现上最好(图6)。