一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

1.本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用。


背景技术：

2.植物害虫尤其农作物害虫对于粮食安全、农产品产量和品质是重要的威胁之一。目前对植物害虫的防控技术主要有化学农药防控、物理防控、农业技术防控和生物防控等，每一种防控技术都各有优势有存在不足，而植物害虫生物防治因具有环境安全风险较小、防治作用较持久、易于与其他植物保护技术相协调并能节约能源等优点，一直被公认为是害虫综合治理中一项环境友好的、最节约的方法。该方法既是农业可持续发展与农产品安全生产的保障，又符合保护生物多样性、保护生态安全的需要。进入21世纪以来，随着全球对环境保护和农产品安全的愈加关注，生物防治技术其在植物保护中的地位与作用愈加突显，其在支撑现代农业可持续发展，保障农产品质量安全，减少环境污染，保护生物多样性与生态安全，维护公众健康等方面均发挥着其他害虫防治方法不可替代的关键作用。在虫害防治中生物防治技术主要有植物发酵液活性物质、生防微生物、昆虫天敌等，其中生防微生物被认为是更生态环保的防控技术物质，如球孢白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌和苏云金芽孢杆菌等。
3.苏云金芽孢杆菌，简称bt，是一种自然界广泛存在的杆状细菌，其区别于其他芽孢杆菌的明显特征是在芽孢生长期能够产生伴孢晶体，这些伴胞体对许多种类的害虫有杀虫活性，除了伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌还会产生杀虫蛋白、苏云金素、增效蛋白、几丁质酶、溶细胞素等具有杀虫活性的多种物质，不同的bt菌株产生的杀虫活性物质的种类不同，杀虫谱不同，活性也不同，而且苏云金芽孢杆菌的杀虫特异性比较高，一般情况下某一个菌株只对某一类害虫具有较高杀虫活性。因此针对防控目标优选高活性、强抗逆和在土壤及寄主中高定殖的新菌种，是提高植物害虫防控效果的有效措施。本发明主要针对植物害虫尤其地下虫害从生境土壤优选高活性目标生防菌株，为其高效生态防控提供技术和物质支撑。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌，该苏云金芽孢杆菌耐旱、耐盐碱、在土壤和植株中定殖能力强，发酵液活性物质富含多种杀虫抑菌化合物和植物生长调节物质。
5.上述苏云金芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis，保藏编号为cgmcc no.24483。
6.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis从甘肃榆中县健康甘蓝根际土壤中通过富集、纯化分离、复壮和拮抗活性筛选，得到具备高活性作用的芽孢杆菌属菌株bat-1807，经过形态观察、生理生化鉴定和16s rdna分子鉴定最终确定该菌株为苏云金芽孢杆
菌bacillus thuringiensis。
7.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，nacl 8 g，酵母膏6 g mnso4·
h2o 0.008g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 ml，ph 7.0。该分离纯化培养基促进苏云金芽孢杆菌富集，提高了其分离纯化效率。
8.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis耐旱，能耐受模拟环境的重度干旱，即pge6000浓度为150～270g/l均能生长繁殖。
9.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis为耐盐碱菌株，在nacl浓度10%～20%或ph9～ph13的中度以上模拟盐、碱环境下均能生长繁殖。
10.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis在植物根茎叶及其根围土壤能稳定定殖，定殖菌数在103cfu/ml～105cfu/ml ，其中在植物根和根围土壤的定殖能力强，根围土壤中定殖菌数30天内保持105cfu/ml以上，根内定殖数20天内保持104cfu/ml以上，在叶和茎内定殖较弱，定殖菌数在103cfu/ml左右。
11.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis的发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏8 g，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，mnso4·
h2o0.005g，k2po
4 0.005g，nacl 5g，蒸馏水容至1000 ml，ph7.0。该发酵培养基促进苏云金芽孢杆菌生长繁殖，提高了其发酵液的含菌量和芽孢量，使其杀虫活性显著提高。
12.所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis发酵液活性物质种类比较丰富，特有二羟基肉桂酸、高香草酸、氨基丁醛、乙基二甲基吡嗪、甲基脱氧尻霉素、吡啶碱、肽、复合氨基酸、鱼藤酮、碳烯脱氢哌嗪和四氢吡咯等杀虫抑菌化合物，以及单氨基酸群、植物激动素等植物生长调节物质，促进植物健壮，增强植物抗病抗虫能力。
13.本发明的目的二是提供苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis在植物地下害虫防控中的应用，所述苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis活菌与发酵液活性物质共同作用，其主要杀虫谱为粘虫 、小菜蛾等鳞翅目害虫，蚜虫等同翅目害虫和根结线虫、根腐线虫等作物线虫。 苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis发酵液10倍以下稀释液对以上靶标害虫的校正累计死亡率为61.64%～92.42% ，其中对线虫和蚜虫毒力强，对粘虫和小菜蛾等鳞翅目害虫毒力相对较弱。
14.苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis发酵液能有效防控根结线虫、根腐线虫和孢囊线虫，平均防治效果为87%～90%，对鳞翅目害虫小地老虎也有较好作用，平均防治效果为85.38%，与对照药剂均不存在显著性差异（p≥0.05））。
附图说明
15.图1：苏云金芽孢杆菌bat-1807菌落形态图2为本发明苏云金芽孢杆菌bat-1807耐旱能力；图3为本发明苏云金芽孢杆菌bat-1807耐酸碱能力；图4为本发明苏云金芽孢杆菌bat-1807耐盐能力；图5为本发明苏云金芽孢杆菌bat-1807在黄瓜植株及其根围土壤的定殖能力。
具体实施方式
16.生防菌株的分离、纯化和分类鉴定1.1菌株的分离、纯化1.1.1主要培养基na培养基，lb培养基，均为现有常规配方。
17.分离纯化培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨10g，nacl8g，酵母膏6gmnso4·
h2o0.008g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000ml，ph7.0。
18.菌株分离纯化选取榆中县十字花科蔬菜未连作的甘蓝种植地，且所有甘蓝健康未生病。甘蓝苗移栽后60天左右，采用五点法取样。选长势健康一致的甘蓝植株轻轻拔出,将植株自根茎处剪断,装入无菌袋冷藏保存带回实验室。抖落根上松散的附着土,称取根5g，置于盛有80ml灭菌的0.1%水琼脂的三角瓶中,20℃,200rmp/min匀速振荡30min,得到甘蓝根际土壤悬浮液，静置30分钟。
19.用移液枪吸取1ml震荡均匀的菌悬液，置入装有9ml无菌水的试管中，振荡均匀，进行系列稀释至10-8
。选取10-8
、10-7
、10-6
、10-5
、10-4
和10-2
6个稀释梯度分别在分离纯化培养基平板上进行涂布，每个浓度梯度重复3次，每平板取稀释液200
µ
l。各试验平板于28℃下倒置培养2～3d，挑取平板上特征相异的单菌落，28℃下继续进行多次划线纯培养，直至平板上菌落形态单一为止。编号，接种于斜面试管中培养、保藏6个月。活化发酵保藏菌，采用40wuv和0.02
µ
g/mlntg复合诱变处理筛选抑菌活性强、传代稳定的菌株，编号，接种于斜面试管中培养、保藏备用。
20.高活性菌株筛选挑取消毒后的根结线虫j2幼虫放于灭菌的24孔中，每孔加入2ml处理液，置25℃培养箱中恒温培养，于72进行观察计数，采用针触法判断线虫死亡情况。将1.1中分离纯化的菌株发酵液为处理，发酵培养基为空白对照。每处理重复3次。
21.死亡率%=死虫数/试验虫数
×
100表1：高活性菌株筛选结果注释：表中列出的是拮抗活性最强的前五株1.1.2中分离纯化获得菌；表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
22.依据表1结果选取拮抗活性最高的菌株bat-1807做进一步分类鉴定。
23.高拮抗活性菌株bat-1807分类鉴定 1.1.4.1形态学鉴定用接种环挑取新鲜菌株bat-1807接于na培养基中，将其放置于28℃恒温培养箱中培养48h后进行观察菌落形态，并在显微镜下观察菌体的形状、芽孢的有无。
[0024] 1.1.4.2生理生化测定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对接触酶反应、淀粉水解、mr试验、麦芽糖、乳糖、d-葡萄糖和硝酸盐等生理生化指标进行观测。
[0025] 1.1.4.316srdna序列分析细菌dna提取采用蛋白酶-sds法制备，扩增引物:27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'、1492r:5'-tacggytaccttgttacgactt-3'，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及同源性分析。
[0026] 1.1.4.4鉴定结果菌株bat-1807的菌落圆形，乳白色，表面湿润起皱，中央稍隆起，边缘较整齐（见图1）。革兰氏染色呈阳性，杆状、端生或中生芽孢,有不规则晶体。接触酶反应、葡萄糖发酵、酯酶反应、硝酸盐还原、明胶液化反应、柠檬酸盐利用试验、果糖发酵、甘露醇水解、麦芽糖发酵均为阳性，淀粉水解、vp试验、蛋白酶反应、mr试验、蔗糖发酵和乳糖发酵均为阴性。菌株的16srdna序列与ncbi数据比对分析和多株苏云金芽孢杆菌菌株归于同一簇群，同源性在99%-100％。综合形态学特征、生理生化特征和16srdna分子鉴定结果，菌株1807为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，终编号bat-1807。
[0027]
二、特性及效果试验：1苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液制备方法：将菌株bac-1807的108cfu/ml菌悬液以9%接种量接于发酵培养基中，28
±
1℃、200转∕分恒温震荡培养48h，即得苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液。
[0028]
上述发酵培养基配方为牛肉膏8g、酵母膏10g、葡萄糖20g、蛋白胨8g、mnso4·
h2o0.005g、k2po40.005g、nacl5g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.0。
[0029]
苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液主要活性物质。
[0030]
采用甲醇（含同位素标记内标混合物）-超声波提取法，提取苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液发酵液活性物质，送上海阿趣生物科技有限公司进行基于lc-ms和gc-tof-ms非靶标的代谢组学检测分析。结果见表2。
[0031]
表2:苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液主要活性物质
表2结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807的发酵液活性物质主要有各类氨基酸、蛋白、核酸、糖类、有机杂环类、甾醇、芳香族、黄酮类、生物碱和其它有机化合物。其中n-methyl-1-deoxynojirimycin;phytosphingosine;11-dehydrocorticosterone;caffeicacid;21-hydroxypregnenolone;3,4-dihydroxyhydrocinnamicacid;daidzein;dethiobiotin;gentisicacid;glycine;glycyl-glycine;leukotrienec4;methyldopa;xanthohumol;harmalol;hygromycinb;imidaprilat;glycylproline;2,4-undecadiene-8,10-diynoicacid2,3-dehydropiperidide;glycylproline;glycyltyrosine;homovanillicacid;4-aminobutyraldehyde;4-hydroxybenzaldehyde;5-ethyl-2,3-dimethylpyrazine;5-nitro-2-propoxyaniline;rotenone;l-phenylalanine;acetylcholine;l-proline;debrisoquine;pyrrolidine；l-norleucine;l-lysine,l-histidine;l-glutamine;l-glutamicacid;l-arginine;l-serine;l-threonine;l-tyrosine和n-methylnicotinium是苏云金芽孢杆菌bat-1807特有的促健杀虫化合物，有二羟基肉桂酸、氨基丁醛、对羟基苯甲醛、乙基二甲基吡嗪、高香草酸、甲基脱氧尻霉素、吡啶碱、肽、复合氨基酸、鱼藤酮、碳烯脱氢哌嗪和四氢吡咯等杀虫抑菌化合物，抑菌物质能提高杀虫化合物的毒力，还有单氨基酸群、植物激动素是等植物生长调节物质，促进植物健壮，增强植物抗病抗虫能力。
[0032]
、苏云金芽孢杆菌bat-1807耐旱能力测定在灭菌后的100mllb培养基中分别添加经无菌处理过后不同浓度的peg6000，使peg6000的终浓度为0、30、60、90、120、150、180、210、240、270g/l。接入6%苏云金芽孢
杆菌bat-1807种子培养液，在28℃，200 r/min 的条件下震荡培养 48h 后，用分离纯化液体纯培养基调零，读取 700 nm 处的 od 值。peg6000 的浓度为 0-60 g/l 代表轻度干旱，90-150g/l 代表中度干旱，大于 150 g/l 代表重度干旱。
[0033]
图2结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807耐旱能力强， pge6000浓度小于等于270g/l均能生长繁殖，pge6000浓度越小 ，生长繁殖越好。pge6000浓度150g/l～270g/l的重度干旱模拟环境下，处理液od
700nm
值在0.647～0.114，即表示苏云金芽孢杆菌bat-1807也能生长繁殖。
[0034]
、苏云金芽孢杆菌bat-1807耐盐碱能力测定。
[0035]
用接种环挑苏云金芽孢杆菌bat-1807菌落接至分离纯化液体培养基中28℃、180r/min培养24h制成种子液，按6%分别接种到ph7.2含有1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、25% nacl和ph为3、5、7、9、11、13、14的含5g/l nacl的na液体培养基，28℃、180r/min摇床培养48h。用分离纯化液体培养基调零，测各培养液在600nm处的od值，依此判断苏云金芽孢杆菌bat-1807的耐盐碱能力。耐盐能力参考刘彩霞的标准：非耐盐菌株，na cl 含量小于 1.17%；低耐盐菌株，na cl 在 1.17～2.93%；中等耐盐菌株，nacl 浓度在 2.93%～14.63%，高度耐盐菌株：14.63%～30.4%。耐碱能力标准：耐碱微生物，ph值7～9生长，ph＞9.5不能生长；嗜碱微生物，ph值7～9生长；极端嗜碱微生物，最适生长ph值≥10，ph值低于8.9～9则不生长，为专性极端嗜碱微生物；兼性嗜碱微生物，具有能在两种或两种以上不同环境下生存或繁衍后代的能力。
[0036]
图3结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807在ph值5～11能正常生长，小于5，大于11，能生长，但较慢，ph3和ph14时死亡。证明苏云金芽孢杆菌bat-1807耐受酸碱能力较强，尤其耐碱能力强（ph值9～13）。图4结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807在nacl浓度小于15%时能正常生长，15%～25%也能生长，但较慢，25%nacl时死亡。证明苏云金芽孢杆菌bat-1807为高度耐盐菌株。
[0037]
、苏云金芽孢杆菌bat-1807的定殖能力测定 菌株bac-1807在黄瓜根、茎、叶及其根围土壤的定殖能力测定：将苏云金芽孢杆菌bat-1807的利福平和卡那霉素双标记菌株接种于含300 μg/ ml利福平和卡那霉素 200 μg/ml的改良nyda培养液中, 28
±
1 ℃、180 r/min振荡培养72 h, 稀释浓度至10
8 cfu/ml, 以 10.0 ml/株 灌根接种于试验标准的黄瓜植株, 5.0 ml/株喷施于植株表面, 以无菌培养液为对照，共处理500株。接种后1、5、10、15、20、25 d 和30 d 各取1.0 g的根、茎、叶组织及其根围土壤（取紧密附着于根系的土作为根围土）样品。将处理植株根、茎、叶样品各平均分成两份（0.5 g）, 一份表面用70 %酒精擦洗后，于0.1 %升汞中浸泡1.5 ～ 2.0 min , 再用无菌水洗涤5 次, 晾干后剪碎并加入1ml 无菌水磨碎，另一份直接用5ml无菌水分5次各震荡15min,合并震荡液，备用；将根围土（1.0 g）分散于10ml 无菌水中， 200 r/min振荡10min后静置，取上清液稀释成10
－1
、10
－２
、10
－３
、10
－４
。然后分别取上述各样品溶液200 μl 均匀涂布于含300 μg/ ml利福平和卡那霉素 200 μg/ml的改良nyda培养培养基平板上,每个处理样品重复3 次, 28
±
1 ℃ 恒温培养48ｈ后计数。根据每个处理的平均菌落数量，计算每克鲜叶、根、茎及其根围土壤中所含的菌量（ cfu/g ）。
[0038]
图5显示，菌株bas-1692在黄瓜根、茎、叶及其根围土壤的都可以稳定定殖，定殖菌数在103cfu/ml～105cfu/ml ，其中在植物根和根围土壤的定殖能力强，根围土壤中定殖菌
数30天内保持105cfu/ml以上，根内定殖数20天内保持104cfu/ml以上，在叶和茎内定殖相对较弱，定殖菌数在103cfu/ml左右。
[0039]
苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液的杀虫谱及其活性测定6.2.1苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液杀目标害虫活性桃蚜(myzuspersicae)采自西葫芦叶片、无翅孤雌蚜；粘虫（pseudaletiaseparata）为实验室人工饲养，试验用初孵幼虫。苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液用无菌水稀释为原液、2倍液、10倍液、50倍液、100倍液、500倍液和1000倍液，备用。
[0040]
蚜虫毒力试验采用药液浸虫法：将带有蚜虫的叶采下，以毛笔仔细剔除不合要求的个体，置9cm培养皿(皿底铺一层湿滤纸)中,用微型喷雾器将苏云金芽孢杆菌bat-1807各发酵稀释液定量（40ml）均匀喷湿叶片和试虫，合上皿盖，在20℃～25℃、10h/14h自然光周期下培养。重复3次，每处理试虫20头，无菌水处理作对照。分别于12h、24h、48h、72h检查试虫死亡数，计算校正死亡率%。
[0041]
粘虫、小菜蛾毒力测定采用药液喷雾法：取直径9cm的培养皿放入36g人工饲料，铺平，每个培养皿中接入24头初孵粘虫、小菜蛾，用微型喷雾器将苏云金芽孢杆菌bat-1807各发酵稀释液定量（50ml）均匀喷湿饲料和试虫。重复3次，以无菌水为对照。之后将饲料混匀平均分成24份（约1.5g）置于24孔培养板中，每孔接1头处理试虫。在25
±
1℃，75%
±
5%相对湿度，l//d=16h//8h光周期环境下进行饲养，观察。分别于24h、72h、120h和168h后统计幼虫的死亡虫数、活虫数，计算校正死亡率。
[0042]
以用小毛刷触碰虫体后无反应或幼虫表现出中毒症状，如畸形、颤搐、行动迟缓、进食中断、蜕皮停止和生长严重抑制等则被视为死亡。当ck的死亡率超过5%时，判定试验无效。
[0043]
死亡率=死亡虫数/处理总虫数x100%校正累计死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)x100%表2：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对蚜虫的毒杀活性注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
[0044]
表3：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对粘虫的毒杀活性
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
[0045]
表4：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对小菜蛾的毒杀活性注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
[0046]
数据分析：表2结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对蚜虫有较好毒杀活性，bat-1807发酵液浓度越大杀虫活性越强，原液、2倍稀释液、10倍稀释液和50倍稀释液72小时蚜虫校正累计死亡率分别88.12%、83.27%、75.70%和63.35%，稀释100倍以上72小时蚜虫校正累计死亡率在48%以下，杀虫毒力弱，需要辅助增效才能达到应用防治效果。表3、4结果显示，高浓度苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对粘虫和小菜蛾有较好毒杀活性，其原液和2倍稀释液168小时粘虫和小菜蛾校正累计死亡率分别为81.58%、69.12%和74.19%、61.64%，稀释10倍以上168小时粘虫和小菜蛾校正累计死亡率均在在49%以下，杀虫毒力弱，应用时需要改进增效。
[0047]
6.2.2苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液杀线虫活性供试线虫采用室内盆栽的方法保存。根结线虫( meloidogyne hapla)用番茄繁
育，当供试根系上大量卵囊出现时，取出根系，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在 0.5%的次氯酸钠中消毒 3 min、用灭菌水冲洗 3 次，放在有灭菌水的培养皿中，25℃恒温培养，3 d 后每24 h 收集新孵化的2龄幼虫。将分离的根结线虫２龄幼虫配制成悬浮液，浓度为10～11条/10μl，保存，备用；根腐线虫(pratylenchus coffeae) 用马铃薯繁育，当供试马铃薯上大量卵囊出现时，收集卵囊薯，通过淘洗过筛法收集卵囊，将卵囊放在 0.5% 的次氯酸钠中消毒3 min，用灭菌水冲洗3 次，放在含有少量灭菌水的培养皿中，25℃恒温箱中培养，7 d 后开始收集孵化的2龄幼虫。将分离的根腐线虫２龄幼虫配制成悬浮液，浓度为5～6条/10μl，保存，备用。
[0048]
将苏云金芽孢杆菌bat-1807活性，用5 ml含0.3%吐温80的无菌水，将斜面上的菌苔刮下置于装有无菌玻璃球的50 ml锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后，稀释至含菌量大于1
ꢀ×
10
8 cfu/ml，备用。利用９６孔细胞培养板进行杀线活性测定，每孔取10μl线虫悬浮液，然后加入90μl苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液，无菌水为对照，重复6次。25℃的恒温箱中培养，24、48和72ｈ时，分别观察并记录线虫的死亡率。注：线虫的死亡判定标准为虫体僵直，并且使用毛针刺激后依然不活动，则判定线虫死亡。
[0049]
线虫死亡率%＝（死亡线虫数／供试总线虫数）
×
100校正累计死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)x 100%表5：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对根结线虫的毒杀活性注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
[0050]
表6：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对根腐线虫的毒杀活性
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
[0051]
数据分析：表5、6结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对根结线虫和根腐线虫有很强毒杀活性， bat-1807发酵液浓度越大杀虫活性越强，原液、2倍稀释液、10倍稀释液和50倍稀释液72小时根结线虫校正累计死亡率分别为92.42%、84.33%、76.15%和69.40%，72小时根腐线虫校正累计死亡率分别为90.57%、82.79%、71.83%和68.25%，稀释100倍以上72小时两种线虫的校正累计死亡率均在52%以下，杀虫毒力弱，需要辅助增效才能达到应用防治效果。
[0052]
、苏云金芽孢杆菌bat-1807对线虫和地下害虫的防治效果供试植物准备：挑选籽粒饱满的番茄和甘蓝种子用70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗5～6次，然后用40 ℃的无菌水浸泡2 h，(27
±
1) ℃恒温、黑暗催芽，待大部分种子出芽后，挑取出芽情况一致的种子，播种。
[0053]
苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液，采用上述二之1节中方法制备。
[0054]
线虫悬液制备：分别将分离的根结线虫２龄幼虫、根腐线虫２龄幼虫、孢囊线虫2龄幼虫等配制成悬浮液，浓度为15条/10μl，保存，备用。
[0055]
供试药剂: 苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液为试验药剂，5%阿维菌素乳油1500倍稀释液为药剂对照，清水处理为空白对照。
[0056]
防治试验：将育苗基质灭菌，施用体积重量百分比30%的试验药剂、对照药剂和清水（空白对照）于无菌基质，保温（28
±
1℃）保湿放置3天。再分别将制备的根结线虫２龄幼虫、根腐线虫２龄幼虫、孢囊线虫2龄幼虫采用灌注接入法，每穴接种15 ml 线虫悬液，覆一薄层土，保湿放置2天，每种线虫接种3穴盘，标记，播种。另外每种处理选2穴盘接种小地老虎初孵幼虫，每穴接种1头，标记，播种。均在播种后5天后，再将试验药剂、对照药剂和清水按30ml/株的量灌根处理，共处理3次，前2次每次间隔3天，后1次每次间隔7天。所有处理于27
±
1℃，湿度75%～80%，光周期9h / 15h的条件下进行培养。每天观察记录出苗生长情况，40ｄ后调查各处理发病植株数和发病株率（或死亡率），统计防控效果（或校正死亡率）。结果详见表7。
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计算公式：
发病株率(%)=发病株数/调查总株数
ꢀ×
100防治效果(%)=(对照区发病株率－处理区发病株率)/对照区发病株率
ꢀ×
100死亡率=死亡虫数/处理总虫数x 100%校正死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)x 100%表7：苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对线虫和小地老虎的防治效果注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）；数据分析：表7结果显示，苏云金芽孢杆菌bat-1807发酵液对根结线虫、根腐线虫和孢囊线虫2龄幼虫的防治效果分别为 88.24%、89.17%、87.54%，对小地老虎初孵幼虫的校正死亡率为 85.38%，与对照药剂（5%阿维菌素乳油1500倍）相比防治效果较弱一点，但均不存在显著性差异（p≥0.05））。