一种ph响应性的细胞渗透肽及其用途
技术领域
1.本发明属于药物递送系统技术领域，具体涉及一种ph响应性的细胞渗透肽及其用途。
背景技术：2.自第一个细胞渗透肽(cell penetrating peptide,cpp)转录蛋白反式激活因子(transactivator of transcription，tat)被发现可以穿过细胞膜，cpp作为一种药物载体得到广泛关注。cpp一般为5-30个氨基酸的短肽序列，研究认为cpp主要以内吞作用、直接穿透或者多种机制递送与其相结合的物质进入细胞。与其他药物载体相比，cpp具有合成简单、生物相容性佳、对细胞造成的损害较小、完成入胞转运后可降解、有效的组织渗透和与其他给药系统的多种兼容性等优势，并能与生物活性蛋白直接融合重组表达，因此被认为是药物递送的理想载体。
技术实现要素：3.本发明的目的在于提供一种穿越细胞膜能力能够响应ph值调控的细胞渗透肽及其用途。
4.一种ph响应性的细胞渗透肽，其氨基酸序列如序列表seq id no：1所示。
5.所述ph响应性的细胞渗透肽包含疏水性末端和亲水性末端，其中组氨酸成分占亲水端和疏水端总体的40％以上。
6.所述ph响应性的细胞渗透肽在ph值6.2-6.4范围内具有细胞膜穿越能力。
7.所述ph响应性的细胞渗透肽在制备应用于ph值6.2-6.4范围内穿越细胞膜药物中的应用。
8.本发明的有益效果：本发明细胞渗透肽可以实现在ph值调控下选择性穿越细胞膜，在ph值6.2-6.4范围酸性环境较7.0-7.4中性环境下具有更强的细胞膜穿越能力。本发明具有上述特性的细胞渗透肽可用于药物递送系统，实现在ph值6.2-6.4范围下的精准给药。
附图说明
9.图1为不同ph值下本发明细胞渗透肽的穿越细胞膜能力的比较。
具体实施方式
10.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
11.实施例1：细胞渗透肽的筛选和制备
12.本发明设计了同时包含疏水性末端和亲水性末端的细胞渗透肽，其中组氨酸成分
占亲水端和疏水端总体的40％以上，按照该原则筛选得到本细胞渗透肽。
13.具体制备方式如下：
14.1、溶剂的处理
15.dmf、甲醇在使用前用g3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。
16.2、树脂的充分溶胀
17.称取2.0g氨基树脂于洁净干燥的反应管中，加入15ml dmf，室温活化30min左右。
18.3、接第一个氨基酸
19.室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1mmol 5倍摩尔过量的c端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的dmap，5倍摩尔过量的dic，dmf做溶剂室温反应3h。反应完毕用dmf洗4～6次，每次5-6ml。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用dmf洗4～6次，每次5-6ml。(作用：封闭掉没有反应的空载树脂上的活性微点。)
20.4、fmoc保护基的离去
21.抽滤去掉上步溶剂，将10ml 20％的哌啶dmf溶液加入到树脂中，n2搅拌10min后滤出溶液，再加入10ml 20％的哌啶dmf溶液，n2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用dmf洗4次，甲醇洗2次，每次5-6ml。
22.5、茚三酮检测脱除效果
23.取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃
–
110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。
24.6、接第二个氨基酸及fmoc保护基脱除
25.称取3倍摩尔过量的c端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的hbtu和3倍摩尔过量的hobt于反应管中，加入适量dmf溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的(纯的)diea，室温反应40min，用dmf洗4～6次，每次5-6ml。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10ml 20％的哌啶dmf溶液脱fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用dmf洗4次，甲醇洗2次，每次5-6ml。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
26.7、以此类推，重复2.6的步骤，直到合成到n端最后一个氨基酸，去掉fmoc保护基，然后抽干。
27.8、加入醋酸酐的dmf溶液反应2个小时，抽干。
28.9、树脂的脱落及纯品分离检测
29.最后用三氟乙酸切割液(95％tfa：2％tis：2％edt：1％h2o)切割2h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气尽量吹干，再用乙醚沉淀，离心，然后用乙醚洗3～5次，得白色固体，用纯水溶解后，经hplc脱盐提纯，冻干后析出晶体，取少量ms分析。
30.实施例2：不同ph值下细胞渗透肽的穿越细胞膜能力的比较
31.1、用0.01mg/ml pll溶液包被载玻片、盖玻片、六孔板等过夜。
32.2、次日，弃去六孔板的pll溶液，用75％的酒精洗三次，每次3分钟，洗净后吹干。
33.3、按1
×
105密度接种bend.3细胞至六孔板，2-3天后观察细胞生长至70％-80％左右。
34.4、将这些ph响应型cpp分别与鼠神经生长因子以摩尔比20：1的比例混合(鼠神经
生长因子为0.5μg)溶于ph为7.4与6.3的1ml pbs中置于1.5ml ep管中，并在室温孵育30分钟。
35.5、弃去六孔板里的培养基，将预形成的1ml复合物溶液加入六孔板内，在37％细胞培养箱中孵育30分钟。
36.6、然后再加入1ml含有胎牛血清的完全培养基，并将细胞再次放入培养箱中孵育4-6小时。
37.7、取出转染后的细胞，从六孔板中小心吸出液体，每孔加入pbs缓冲液2ml，浸泡盖玻片5分钟，重复3遍。
38.8、吸除细胞用pbs，每孔加入4％多聚甲醛2ml浸泡盖玻片，于4℃冰箱中进行细胞固定，固定时间为40分钟。
39.9、吸除4％多聚甲醛，每孔加入pbs 2ml浸泡盖玻片5分钟，重复3次。
40.10、小心吸除pbs，每孔加入浸泡盖玻片0.3％triton x-100 15分钟。
41.11、吸除0.3％triton x-100，每孔加入pbs 2ml浸泡盖玻片5分钟，重复3次，以洗净六孔板中多余的triton x-100。
42.12、吸除pbs后，每孔加入5％封闭用山羊血清1ml浸泡盖玻片，室温封闭1小时。
43.13、小心吸除5％封闭用山羊血清，将盖玻片放在玻璃载玻片上，细胞面向上，每片加配制好的一抗200μl，一抗为兔抗鼠ngf单克隆抗体(1：300)，用1％封闭用山羊血清配制，放入避光湿盒，4℃孵育过夜(孵育时间18h-20h)。
44.14、小心吸除一抗，将盖玻片放回六孔板，每孔加入pbs 2ml浸泡盖玻片5分钟，重复3次，以洗净多余一抗。
45.15、小心吸除pbs，将盖玻片放在玻璃载玻片上，细胞面向上，每片加配制好的应荧光二抗200μl，荧光二抗为alexa fluor 488标记山羊抗兔荧光二抗(1：500)，用1％封闭用山羊血清配制，放入避光湿盒，室温避光孵育1h。
46.16、小心吸除荧光二抗，每孔加pbs 2ml浸泡盖玻片5分钟，重复3次，以洗净多余荧光二抗。
47.17、然后每孔加入hoechst33342核染料(1：1000)500μl，避光孵育5分钟。
48.18、小心吸除核染料，每孔加入去离子水2ml漂洗盖玻片5分钟，漂洗3次，用滤纸小心吸去多余去离子水后，在干燥的玻璃载玻片上滴50μl封片剂，将盖玻片放在封片剂上，细胞面向下，避免气泡产生，进行封片，室温避光晾干后在四周涂上指甲油固定盖玻片。
49.19、用倒置荧光显微镜观察。
50.测定结果显示(图1)，细胞渗透肽可以实现在ph值调控下选择性穿越细胞膜，在ph值6.3酸性环境较7.4中性环境下具有更强的细胞膜穿越能力。
51.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。