促进细胞增殖的方法及包含细胞因子的化妆品或药物与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域。更具体地，涉及促进成纤维细胞增殖的组合物、富含细胞因子的成纤维细胞提取物及其制备和在化妆品或药物中的用途。


背景技术：

2.人的皮肤由包括角质层的表皮、真皮以及结合组织构成，其中角质层由通过作为表皮(epidermis)基底细胞的角质细胞(keratinocyte)的分化过程形成的死去的细胞层构成，起到从外部环境的影响中保护人体的作用。并且，存在于皮肤内部的真皮层由胶原蛋白(collagen)和弹性蛋白(elastin)构成，给皮肤带来弹性，起到防止皮肤下坠的作用。而人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast，人成纤维细胞)是皮肤组织重要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，具有维持皮肤结构稳定、保持强度和弹性、修复损伤等功能。
3.植物天然成分能够调控成纤维细胞的增殖及其分泌胶原蛋白的能力已经有所报道，例如二氢黄酮衍生物或其盐能够通过作用角质化细胞从而增强成纤维细胞产生胶原蛋白的能力(cn101384246b)；丝瓜皂苷和苦瓜皂苷能够促进成纤维细胞的增殖，促进成纤维细胞分泌生物活性物质(cn108265023a)；人参皂苷ro或含有该皂苷的植物提取物能够促进成纤维细胞生长培养基中胶原蛋白的合成(cn1146153)。另一方面，经植物天然成分诱导培养获得的成纤维细胞提取物通常被发现具有良好的美容或者医药方面的用途，例如经丝瓜皂苷和苦瓜皂苷诱导培养获得的成纤维细胞提取物被发现具有促进皮肤或毛发新生、促进创伤修复、抗皮肤光老化和减少疤痕形成等生物学功效。
4.氧化苦参碱(oxymatrine,om)，化学结构式如下式1。其具有多种药理作用，如抗癌、消炎、免疫调节、抗病毒和抗肝纤维化等，然而，迄今未见氧化苦参碱用作成纤维细胞的培养及诱导其产生更多有利的细胞因子的报道。
5.

技术实现要素：

6.针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供促进成纤维细胞增殖的组合物、富含细胞因子的成纤维细胞提取物及其制备和在化妆品或药物中的用途。
7.本发明其中一个发明目的是提供一种促进成纤维细胞增殖的组合物，包含氧化苦参碱。在本发明其中一个实施方式中，所述氧化苦参碱的浓度为0.1～3μmol/l；例如可以是0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l、0.6μmol/l、0.7μmol/l、0.8μ
mol/l、0.9μmol/l、1.0μmol/l、1.1μmol/l、1.2μmol/l、1.3μmol/l、1.4μmol/l、1.5μmol/l、1.6μmol/l、1.7μmol/l、1.8μmol/l、1.9μmol/l、2.0μmol/l、2.1μmol/l、2.2μmol/l、2.3μmol/l、2.4μmol/l、2.5μmol/l、2.6μmol/l、2.7μmol/l、2.8μmol/l、2.9μmol/l或3μmol/l；更好的是0.5μmol/l、1.0μmol/l、1.5μmol/l、2.0μmol/l或3.0μmol/l；最好的是0.5μmol/l。
8.基于大量的前期研究发现，氧化苦参碱浓度介于0.1～3μmol/l时有促进成纤维细胞贴壁和增殖的能力，并且获得的细胞上清液中检测到更高含量的胶原蛋白和细胞因子；而随着氧化苦参碱浓度的增加，对成纤维细胞的增殖能力促进作用渐弱；当氧化苦参碱浓度＞10μmol/l时表现为不促进甚至抑制成纤维细胞的增殖及其分泌细胞因子的能力。
9.由表1可知：浓度范围介于0.1～3μmol/l之间的氧化苦参碱对皮肤成纤维的增殖具有促进的作用，作用随着浓度的降低而增强；10.0μmol/l的氧化苦参碱对皮肤成纤维细胞没有毒性作用，但也没有促进增殖的作用；12.0μmol/l氧化苦参碱对细胞具有一定的毒性作用，显微镜下观察部分细胞形态异常。
10.由表2可知，加入0.1～10μmol/l的氧化苦参碱均能促进成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白及分泌tgf-β1和bfgf，其中0.5～3μmol/l的氧化苦参碱对成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白及分泌tgf-β1和bfgf的促进效应最为明显，与对照组相比存在极显著的差异(p＜0.01)；随着氧化苦参碱浓度的增加，促进效应逐渐减弱。
11.另一方面，发明人发现，采用特定浓度的氧化苦参碱与右旋糖酐共同诱导培养成纤维细胞，其增殖能力、胶原蛋白合成能力更加显著，从而获得的上清液中胶原蛋白、细胞因子的含量更高。优选地，在本发明其中一个实施方式中，右旋糖酐的浓度通常介乎0.01～0.1％，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％；优选为0.05％。
12.由表3可知，0.05％的右旋糖酐与0.5～3.0μmol/l氧化苦参碱联合诱导培养后对成纤维细胞的促增殖作用、胶原蛋白合成及细胞因子分泌效应显著强于右旋糖酐或氧化苦参碱单独诱导培养时，联合诱导培养获得的培养上清中collagenⅰ的含量高达200μg/ml以上。
13.本发明另一发明目的在于提供一种富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
14.步骤1：获取成纤维细胞；
15.步骤2：将成纤维细胞置于含有所述促进成纤维细胞增殖的组合物的基础培养基中培养，收集上清，过滤，浓缩，灭菌，即得。
16.在本发明其中一个实施方式中，所述步骤1中成纤维细胞可以来源于皮肤组织，其制备可以包括以下具体步骤：
17.对皮肤组织样本进行预处理，剪成组织块，酶化消化得到成纤维细胞进行原代培养，待细胞融合度达到80-90％时，按比例进行传代培养，获得成纤维细胞群。
18.在本发明其中一个实施方式中，所述预处理包括：用含有青霉素的磷酸盐缓冲液冲洗皮肤组织样本1-3次。优选的，磷酸盐缓冲液中青霉素的浓度为100u/ml。
19.在本发明其中一个实施方式中，酶化消化优选采用0.25％的中性蛋白酶过夜培养，过夜后分离表皮与真皮；收集的真皮组织采用胶原蛋白酶消化1～3小时。
20.在本发明其中一个实施方式中，步骤2中成纤维细胞最好是经传代至3-5代的处于
生长旺盛期的细胞。
21.在本发明其中一个实施方式中，步骤2中基础培养基中含有0.1～3μmol/l浓度的氧化苦参碱，氧化苦参碱的浓度可以是0.1～3μmol/l范围内的任意值，例如可以是0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l、0.6μmol/l、0.7μmol/l、0.8μmol/l、0.9μmol/l、1.0μmol/l、1.1μmol/l、1.2μmol/l、1.3μmol/l、1.4μmol/l、1.5μmol/l、1.6μmol/l、1.7μmol/l、1.8μmol/l、1.9μmol/l、2.0μmol/l、2.1μmol/l、2.2μmol/l、2.3μmol/l、2.4μmol/l、2.5μmol/l、2.6μmol/l、2.7μmol/l、2.8μmol/l、2.9μmol/l或3μmol/l；更好的是0.5μmol/l、1.0μmol/l、1.5μmol/l、2.0μmol/l或3.0μmol/l；最好的是0.5μmol/l。
22.在本发明其中一个优选的实施方式中，步骤2中基础培养基中还含有0.01～0.1％的右旋糖酐，右旋糖酐的浓度可以是0.01～0.1％范围内的任意值，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％；优选为0.05％。
23.在本发明其中一个实施方式中，所述步骤2中基础培养基为dmem培养基。
24.在本发明其中一个实施方式中，所述步骤2中成纤维细胞的培养条件为：37℃，5％co2。
25.在本发明其中一个实施方式中，步骤2中采用离心的方法收集细胞上清液，离心速度为1000～1200rpm，离心时间为3-6分钟。
26.在本发明其中一个实施方式中，步骤2中过滤通常采用微孔滤膜进行，滤膜的孔径通常为0.22μm。
27.本发明另一目的在于提供上述制备方法制备得到的富含细胞因子的成纤维细胞提取物。本发明提供的成纤维细胞培养上清富含胶原蛋白及生长因子(tgf-β1、bfgf)，对抗皮肤老化、促进皮肤修复具有卓越的生物学功效。
28.据此，本发明另一目的在于提供上述制备方法制备得到的富含细胞因子的成纤维细胞提取物在制备化妆品或药物中的用途。
29.据此，本发明另一目的在于提供用作增加皮肤胶原蛋白的组合物，包含：
30.(a)所述富含细胞因子的成纤维细胞提取物；
31.(b)渗透增强剂；
32.(c)溶剂。
33.在所述组合物中，富含细胞因子的成纤维细胞提取物可作为唯一或者主要的活性成分存在，当其作为唯一的活性成分存在时，其在所述组合物中的含量通常介乎0.01～99.99％。
34.在所述组合物中，渗透增强剂优选为聚二甲基硅氧烷。
35.据此，本发明另一目的在于提供用作减少皮肤的皱纹的组合物包含：
36.(a)所述富含细胞因子的成纤维细胞提取物；
37.(b)渗透增强剂；
38.(c)溶剂。
39.在所述组合物中，富含细胞因子的成纤维细胞提取物可作为唯一或者主要的活性成分存在，当其作为唯一的活性成分存在时，其在所述组合物中的含量通常介乎0.01～99.99％。
40.在所述组合物中，渗透增强剂优选为聚二甲基硅氧烷。
41.据此，本发明另一目的在于提供用作降低细胞衰老速率的组合物，其特征在于，包含：
42.(a)所述富含细胞因子的成纤维细胞提取物；
43.(b)渗透增强剂；
44.(c)溶剂。
45.在所述组合物中，富含细胞因子的成纤维细胞提取物可作为唯一或者主要的活性成分存在，当其作为唯一的活性成分存在时，其在所述组合物中的含量通常介乎0.01～99.99％。
46.在所述组合物中，渗透增强剂优选为聚二甲基硅氧烷。
附图说明
47.图1为右旋糖酐与氧化苦参碱联合促成纤维细胞增殖试验结果。
具体实施方式
48.以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
49.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
50.试验例一、氧化苦参碱对皮肤成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成及细胞因子分泌的影响
51.1.1皮肤成纤维细胞原代分离培养、传代：取经检测合格的健康皮肤组织块，采用含有100u/ml青霉素的磷酸盐缓冲液冲洗皮肤组织样本3次，剪成2cm
×
2cm的组织碎块；将组织碎块转移至培养皿中，加入2ml 0.25％的中性蛋白酶，37℃消化过夜，过夜分离表皮与真皮；真皮组织采用胶原蛋白酶37℃消化3h，除去胶原酶，收集成纤维细胞，pbs冲洗细胞3次；将收集的成纤维细胞移入培养皿中，加入含10％fbs的dmem培养基，充分吹匀后置于37℃、5％co2条件下培养，每3天补加新鲜培养液，约14天后细胞生长至80-90％融合度时，0.25％胰蛋白酶消化，按1:2的比例进行传代培养。
52.1.2对成纤维细胞增殖的影响：取p3代经过鉴定生长状态及特征符合的成纤维细胞，采用dmem培养基调整细胞密度为1
×
104cell/ml，接种细胞至96孔板中，每孔加入1ml细胞悬液，细胞培养24h后弃去原培养液，分别加入含有不同浓度氧化苦参碱的dmem培养基进行培养72h；每孔加入10μl cck-8溶液，继续培养3h，终止培养，采用酶联免疫法酶标仪测定各组细胞于490nm波长处的吸光度，计算细胞相对活率(rgr),rgr％＝试验组平均吸光度/对照组平均吸光度
×
100％，结果参见表1。
53.表1：
54.氧化苦参碱浓度(μmol/l)rgr(％)0(对照组)100.00
±
0.000.1115.38
±
7.54
*
0.5149.26
±
15.34
**
1.0131.73
±
10.61
**
1.5127.82
±
11.49
**
2.0123.18
±
9.52
**
3.0111.19
±
8.14
*
5.0104.67
±
5.3710.0100.92
±
7.4112.082.36
±
3.64
55.与对照组相比，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
56.由表1可知，浓度范围介于0.1～3μmol/l之间的氧化苦参碱对皮肤成纤维的增殖具有明显促进的作用，作用随着浓度的降低而增强；10.0μmol/l的氧化苦参碱对皮肤成纤维细胞没有毒性作用，但也没有促进增殖的作用；12.0μmol/l氧化苦参碱对细胞具有一定的毒性作用，显微镜下观察部分细胞形态异常。
57.1.3对成纤维细胞胶原蛋白合成及细胞因子分泌的影响：取p3代经鉴定生长状态及特征符合的成纤维细胞，采用dmem培养基调整细胞密度为1
×
104cell/ml，接种细胞至96孔板中，每孔加入1ml细胞悬液，细胞培养24h后弃去原培养液，分别加入含有不同浓度氧化苦参碱的dmem培养基进行培养72h，1200rpm离心3min，收集各组细胞培养上清，上清采用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，采用elisa试剂盒按照说明书检测各组细胞培养上清中ⅰ型胶原蛋白、tgf-β1和bfgf的含量，结果见表2。
58.表2：
59.oxymatrine(μmol/l)collagenⅰ(μg/ml)tgf-β1(ng/ml)bfgf(pg/ml)0(对照组)72.36
±
4.224.125
±
0.36134.25
±
4.180.1102.50
±
10.12
**
5.260
±
0.442
*
47.39
±
6.27
*
0.5174.33
±
15.33
**
8.337
±
0.295
**
81.46
±
8.39
**
1.0193.57
±
20.18
**
7.652
±
0.313
**
85.52
±
5.09
**
1.5183.05
±
16.49
**
7.158
±
0.274
**
73.94
±
3.17
**
2.0171.29
±
18.73
**
6.903
±
0.318
**
70.69
±
5.01
**
3.0150.14
±
12.44
**
6.368
±
0.513
**
64.02
±
3.79
**
5.0102.38
±
10.21
**
5.954
±
0.237
**
51.25
±
2.16
**
10.093.34
±
13.96
*
5.153
±
0.194
*
42.58
±
4.01
*
12.070.47
±
9.344.021
±
0.47230.21
±
5.28
60.与对照组相比，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
61.由表2可知，加入0.1～10μmol/l的氧化苦参碱均能促进成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白及分泌tgf-β1和bfgf，其中0.5～3μmol/l的氧化苦参碱对成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白及分泌tgf-β1和bfgf的促进效应最为明显，与对照组相比存在极显著的差异(p＜0.01)；随着氧化苦参碱浓度的增加，促进效应逐渐减弱。
62.试验例二、右旋糖酐与氧化苦参碱联合促成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成及细胞因子分泌效应
63.按照试验例一方法检测不同右旋糖酐与氧化苦参碱对成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成及细胞因子分泌的影响，结果参见图1和表3。
64.如图1所示：0.05％的右旋糖酐与0.5～3.0μmol/l氧化苦参碱联合诱导培养对成
纤维细胞具有显著强于右旋糖酐或氧化苦参碱单独诱导培养的促增殖作用，与对照组相比存在显著差异(p＜0.05)，0.05μmol/l和1.0μmol/l的氧化苦参碱与右旋糖酐联合存在极显著的差异(p＜0.01)；两者中尤以1.0μmol/loxymatrine+0.05％dextran促增殖作用最为显著，细胞相对活率达到166.74％。
65.表3：
[0066][0067]
与对照组相比，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
[0068]
由表3可知，0.05％的右旋糖酐与0.5～3.0μmol/l氧化苦参碱联合诱导培养后对成纤维细胞的促增殖作用、胶原蛋白合成及细胞因子分泌效应显著强于右旋糖酐或氧化苦参碱单独诱导培养时，联合诱导培养获得的培养上清中collagenⅰ的含量高达200μg/ml以上。
[0069]
实施例一：富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备
[0070]
皮肤成纤维细胞原代分离培养、传代：取经检测合格的健康皮肤组织块，采用含有100u/ml青霉素的磷酸盐缓冲液冲洗皮肤组织样本3次，剪成2cm
×
2cm的组织碎块；将组织碎块转移至培养皿中，加入2ml0.25％的中性蛋白酶，37℃消化过夜，过夜分离表皮与真皮；真皮组织采用胶原蛋白酶37℃消化3h，除去胶原酶，收集成纤维细胞，pbs冲洗细胞3次；将收集的成纤维细胞移入培养皿中，加入含10％fbs的dmem培养基，充分吹匀后置于37℃、5％co2条件下培养，每3天补加新鲜培养液，约14天后细胞生长至80-90％融合度时，0.25％胰蛋白酶消化，按1:2的比例进行传代培养；
[0071]
成纤维细胞提取物的制备：取p3代经过鉴定生长状态及特征符合的成纤维细胞，采用dmem培养基调整细胞密度为1
×
104cell/ml，接种细胞至96孔板中，每孔加入1ml细胞悬液，细胞培养24h后弃去原培养液，加入含有0.5μmol/l氧化苦参碱和0.05％质量右旋糖
酐的dmem培养基进行培养72h，1200rpm离心3min，收集各组细胞培养上清，上清采用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冻干，即得。
[0072]
实施例二：富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备
[0073]
与实施例一区别在于，成纤维细胞提取物的制备步骤，氧化苦参碱的浓度为1.0μmol/l，其余参数与实施例一相同。
[0074]
实施例三：富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备
[0075]
与实施例一区别在于，成纤维细胞提取物的制备步骤，氧化苦参碱的浓度为1.5μmol/l，其余参数与实施例一相同。
[0076]
实施例四：富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备
[0077]
与实施例一区别在于，成纤维细胞提取物的制备步骤，氧化苦参碱的浓度为2.0μmol/l，其余参数与实施例一相同。
[0078]
实施例五：富含细胞因子的成纤维细胞提取物的制备
[0079]
与实施例一区别在于，成纤维细胞提取物的制备步骤，氧化苦参碱的浓度为3.0μmol/l，其余参数与实施例一相同。
[0080]
表4：含有成纤维细胞提取物的护肤精华(质量分数)
[0081]
组别环五聚二甲基硅氧烷成纤维细胞提取物丙三醇1#2％实施例一，余量10％2#2％实施例二，余量10％3#2％实施例三，余量10％4#2％实施例四，余量10％5#2％实施例五，余量10％
[0082]
(一)皮肤刺激性试验
[0083]
按照《化妆品卫生规范》(2007年版)中的多次皮肤刺激性试验测试组别1#～5#护肤精华对皮肤的刺激性：取新西兰种大白兔，每组取2ml样品，保证受试物与皮肤有良好的接触，试验前24h将试验动物背部脊柱两侧背毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围3cm
×
3cm，涂抹面积为2
×
2cm，一侧涂受试物，一侧做对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第2天开始，每次涂抹前剪毛，用温水清除残留受试物，1h后观察结果，计算每天每只动物平均积分，判断皮肤刺激强度，结果如下5所示。
[0084]
表5：
[0085]
组别每天每只动物积分均值刺激强度1#0.16无刺激性2#0.28无刺激性3#0.35无刺激性4#0.38无刺激性5#0.41无刺激性
[0086]
(二)皱纹改善试验
[0087]
选取100名自愿者，随机分为五组，每组20人，采用皮肤弹性测试仪mpa580(德国courage+khazaka(ck))对每组自愿者使用前及使用28天后的皮肤弹性度(r2值)进行测试，并分析皮肤紧致度变化；采用皮肤光学三维测量系统(primos，gfmesstechnik公司)对每组
自愿者使用前及使用28天后两侧眼角外观情况进行测量并分析，结果如下表6所示。
[0088]
表6：
[0089]
配方皮肤紧致度变化皱纹平均深度变化皱纹数量变化1#+25.7％-21.5％-24.1％2#+30.2％-27.6％-27.0％3#+28.1％-23.7％-23.3％4#+24.3％-22.7％-21.7％5#+22.4％-20.3％-18.4％
[0090]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。