地衣芽孢杆菌、筛选方法、制品及制备方法与流程

本发明属于微生物，具体涉及一种地衣芽孢杆菌、筛选方法、制品及制备方法。

背景技术：

1、蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。指能够将蛋白质降解成小肽和氨基酸的水解酶，占整个工业酶市场的60％以上。蛋白酶按照其最适反应ph可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，其最适ph分别为ph2.0-5.0、ph6.0-8.0、ph9.0-11.0。

2、研究表明，在低蛋白日粮背景下，蛋白酶在饲料中的添加可以提高营养物质表观消化率，降低排泄物中含氮量，从而有效降低饲料成本并减轻养殖业对环境的污染。碱性蛋白酶因具有底物专一性要求低，水解程度高和成本低的特点；而中性蛋白酶则具有水解产物风味好、苦味小等优点，现已从许多微生物代谢产物中分离纯化得到多种蛋白酶，但应用于饲料生产的高活性中性蛋白酶与碱性蛋白酶的微生物依然只占少数。而且，目前饲料中常用的蛋白酶添加剂通常只具有酸性、中性或者碱性单一蛋白酶活性，且不具备蛋白质、膳食纤维等动物所需营养成分。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的是提供一种地衣芽孢杆菌、筛选方法、制品及制备方法，用以解决现有的蛋白酶添加剂仅为单一蛋白酶活性，和不具备蛋白质、膳食纤维等动物所需营养成分的问题。

2、第一方面，本发明实施例提供了一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：25162。

3、第二方面，本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的筛选方法，包括：

4、从蛋鸡粪便中分离好氧细菌菌株；

5、将分离后的好氧细菌菌株转接到lb培养基上活化，以点接法接种到酪蛋白琼脂培养基上，37℃培养24小时，选出透明圈大小达到预设范围的菌株；

6、将选出的菌株固体培养基上，37℃恒温培养40小时，培养物经干燥箱40℃干燥至含水量6-8％时，测定发酵物的中性蛋白酶与碱性蛋白酶活性，选出中性蛋白酶活性最高的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812。

7、根据本发明的一个实施例，所述固态培养基的基质中含含85％小麦麸、15％稻壳，且含水量为45％。

8、第三方面，本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的制品，包含第一方面所述的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812。

9、第四方面，本发明公开了一种地衣芽孢杆菌制品的制备方法，所述地衣芽孢杆菌为权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812，所述方法包括：对所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812进行斜面培养，培养基的组分含量为酵母粉4-5g/l，氯化钠8-10g/l，蛋白胨8-10g/l，葡萄糖1.5-2g/l，琼脂15-20g/l，培养基ph6.8-7.2，灭菌方式为121℃灭菌30min；培养条件为接种后37℃恒温培养20-30小时；对所述斜面培养后所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812进行液态菌种发酵培养，直到检测出菌体芽孢率达90％以上时，结束培养，得到所述地衣芽孢杆菌的液体制品。

10、根据本发明第四方面的一个实施例，所述液态菌种发酵培养包括：

11、液态一级菌种发酵培养，其中，所述液态一级菌种发酵培养中的培养基的组分含量为酵母粉4-5g/l，氯化钠8-10g/l、蛋白胨8-10g/l、葡萄糖1.5-2g/l，其余为水，总量为1l，培养基的ph6.8-7.2，灭菌方式为在121℃灭菌30min；

12、培养条件为在37℃条件下，采用1l容积三角瓶，每瓶装200-250ml液体培养基，从固态斜面试管接入菌种，摇床转速200-250rpm，培养22-28小时。

13、根据本发明第四方面的一个实施例，所述液态菌种发酵培养还包括：

14、液态二级菌种发酵培养，其中，液态二级菌种发酵培养中的培养基组分含量为豆粕粉60-75g/l，玉米淀粉50-60g/l，葡萄糖4-6g/l，玉米浆5-8g/l，轻质碳酸钙2-4g/l，碳酸钾0.7-1.2g/l，氯化钙1.5-2.5g/l，磷酸氢二钾2-3g/l，中性蛋白酶2-4万u/l，中温淀粉酶1000-2000u/l，ph6.8-7.2；灭菌方式为0.12mpa，121-123℃灭菌20-30min；培养温度为37-38℃。

15、根据本发明第四方面的一个实施例，液态二级菌种发酵培养中的培养基的制备过程包括：将培养基的组分中的所述豆粕粉、所述玉米淀粉、所述葡萄糖、所述玉米浆投入到好氧发酵罐定容，升温至45—50℃；加入提前溶解好中性蛋白酶，搅拌1.5h；将温度升到65-68℃，待温度稳定以后，加入提前溶解好中温淀粉酶，继续酶解1h；酶解完毕，加入所述轻质碳酸钙、所述碳酸钾、所述氯化钙和所述磷酸二氢钾，升温灭菌121-123℃灭菌20-30min。

16、根据本发明第四方面的一个实施例，方法还包括：对液态菌种发酵培养后的菌株进行固态发酵，所述固态发酵的培养基的组成成分，以固形物占比计包括：小麦麸60-80％，豆粕0-15％，稻壳10-20％，基质初始含水量45-55％。

17、根据本发明第四方面的一个实施例，所述固态发酵的培养条件为：培养基在121℃灭菌20-30min，物料冷却至60-70℃，按照4-8％比例接入液态菌种，混合均匀，保持料温35-42℃，好氧发酵，培养时间30-40小时，直到菌株镜检芽孢率达到90％以上时结束发酵，采用70℃以下低温干燥，得到地衣芽孢杆菌的固体制品。

18、本发明的实施例至少具有如下有益效果：

19、根据本发明实施例的地衣芽孢杆菌、筛选方法、制品及制备方法，本方法筛选到1株能产生高中性蛋白酶及碱性蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌菌株，其发酵产物具有极高的中性及碱性蛋白酶活性，在ph6.0-11.0范围内均能够高效催化蛋白质水解。采用该菌株以小麦麸、豆粕及稻壳为主要基质进行固态发酵，可得到一种兼具较高中性与碱性蛋白酶活性，且富含蛋白质、小肽、膳食纤维等营养成分的发酵饲料原料。

技术特征：

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)sly1812，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc 25162。

2.一种地衣芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述固体培养基的基质中含含85％小麦麸、15％稻壳，且含水量为45％。

4.一种地衣芽孢杆菌的制品，其特征在于，包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812。

5.一种地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌为权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)sly1812，所述方法包括：

6.根据权利要求5所述的地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，所述液态菌种发酵培养包括：

7.根据权利要求6所述的地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，所述液态菌种发酵培养还包括：

8.根据权利要求7所述的地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，液态二级菌种发酵培养中的培养基的制备过程包括：

9.根据权利要求5-8任一项所述的地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，还包括：对液态菌种发酵培养后的菌株进行固态发酵，所述固态发酵的培养基的组成成分，以固形物占比计包括：小麦麸60-80％，豆粕0-15％，稻壳10-20％，基质初始含水量45-55％。

10.根据权利要求9所述的地衣芽孢杆菌制品的制备方法，其特征在于，所述固态发酵的培养条件为：培养基在121℃灭菌20-30min，物料冷却至60-70℃，按照4-8％比例接入液态菌种，混合均匀，保持料温35-42℃，好氧发酵，培养时间30-40小时，直到菌株镜检芽孢率达到90％以上时结束发酵，采用70℃以下低温干燥，得到地衣芽孢杆菌的固体制品。

技术总结
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌、筛选方法、制品及制备方法，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)SLY1812，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC25162。本发明实施例的地衣芽孢杆菌，其发酵产物具有极高的中性及碱性蛋白酶活性，在pH6.0‑11.0范围内均能够高效催化蛋白质水解。采用该菌株经过固态发酵，可得到一种兼具较高中性与碱性蛋白酶活性，且富含蛋白质、小肽、膳食纤维等营养成分的发酵饲料原料。

技术研发人员：宋洪宁,李军训,张鑫,徐启民,孙传飞
受保护的技术使用者：山东泰山生力源集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13