一株大青湖黄金杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，特别涉及一株大青湖黄金杆菌及其应用。

背景技术：

1、二氯甲烷(dcm)是一种使用非常广泛的有机试剂，常用作工业溶剂，应用于有机合成工业和化工工业，如制造安全电影胶片、聚碳酸酯，其余用作涂料溶剂、金属脱脂剂，气烟雾喷射剂、聚氨酯发泡剂、脱模剂、脱漆剂。随着工业化、城市化进程的加快，对其需求量也日益增大。它不仅是大气的主要污染物，还是城市和工业污水的重要组成部分，由于不易被降解而除去，所以在大气和水体系中的半衰期分别为70天和700年。环境中90％以上的来源于化工业的使用和废弃物的燃烧；由于是一种挥发性的物质在其中转和运输的过程中也会有大量的逸出从而对大气环境造成严重的污染。另外，机动车燃料在燃烧后排出的尾气和地表面水体中有机污染物的挥发也会产生的污染。

2、二氯甲烷为无色透明液体，有芳香气味。二氯甲烷与明火或灼热的物体接触时能产生剧毒的光气。遇潮湿空气能水解生成微量的氯化氢，光照亦能促进水解而对金属的腐蚀性增强。二氯甲烷微溶于水，溶于乙醇、乙醚。二氯甲烷通过呼吸道、胃肠道和皮肤等途径进入机体，一旦进入机体，70％以上的二氯甲烷进入血液循环分布至全身。二氯甲烷进入生物体内，首先会被细胞色素paso依赖性的混合功能氧化酶(mfo)代谢，某些二氯甲烷经细胞微粒体中的混合功能氧化酶激活后会转化为致癌物,它们通过在蛋白质的酮-烯醇互变异构过程中起催化作用，从而导致细胞蛋白质分子的不可逆转变，进而促进细胞的癌变。

3、对二氯甲烷的处理，国内外主要包括燃烧法、化学吸收法、活性炭吸附法和生物处理法。燃烧法、化学吸收法、活性炭吸附法等物理化学法主要处理二氯甲烷含量较高的工业废气，而对于水体、污泥和空气中的低浓度(<3mg/m3)二氯甲烷，净化效果较差，且能耗大，成本高，易产生二次污染，不易推广。生物处理法是基于微生物对二氯甲烷污染物有较强的适应性，并且能以二氯甲烷作为代谢底物，而使二氯甲烷得到降解与转化的特点产生的，它比传统工艺投资少，运行费用低，操作简单，应用范围广。

4、高效二氯甲烷降解菌株的筛选是生物修复的关键，二氯甲烷降解菌剂相关专利不多，且均未表明菌株的降解性能及应用推广，高效降解菌株的筛选及降解性能优化是生物修复的关键因素，对菌剂的推广应用及二氯甲烷污染的修复至关重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一株大青湖黄金杆菌及其应用，该菌株对二氯甲烷具有显著的降解作用，易于培养且有稳定的传代特性。

2、本发明从某石化公司废水处理装置周围土壤及体系污泥中分离纯化得到菌株yjy22-05，其形态学特征为：为革兰氏阴性菌，该菌株在普通营养琼脂上形成圆形的金黄色菌落，不透明、边缘不整齐、菌落扁平、表面光滑。

3、该菌株的16srdna核苷酸序列如seq id no：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列；该16srdna序列经过blast比对显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与金黄杆菌属(chryseobacterium)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为大青湖黄金杆菌(chryseobacterium daecheongense)的菌株有100％的同源性。

4、经形态学和16s rdna鉴定菌株yjy22-05为大青湖黄金杆菌(chryseobacteriumdaecheongense)，其保藏编号为cgmcc no.24314。

5、本发明还提供一种微生物菌剂，其原料包括保藏编号为cgmcc no.24314的大青湖黄金杆菌。

6、本发明还提供了所述的微生物菌剂的制备方法，所述微生物菌剂包为固体菌剂或液体菌体。

7、所述微生物菌剂为液体菌剂，其制备方法包括：将保藏编号为cgmcc no.24314的大青湖黄金杆菌活化后制备种子液，然后接种于发酵培养基中发酵，收集发酵后的菌体。

8、所述微生物菌剂为固体菌剂，其制备方法包括：将保藏编号为cgmcc no.24314的大青湖黄金杆菌活化后制备种子液，然后接种于发酵培养基中发酵，收集发酵后的菌体依次进行吸附、干燥和粉碎。

9、其中，所述菌种活化为室温条件下活化4h-10h。

10、所述种子液的制备包括：所述种子液的制备包括：将活化后的菌种接种至液体培养基中，于温度为25～37℃，摇床转速为50-170r/min的条件下，振荡培养15-20h。

11、所述发酵为：将大青湖黄金杆菌种子液按体积百分比1％-5％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵；所述高密度发酵的条件为：罐压0.02-0.05mpa，温度为25～37℃，转速为200-300r/min，溶解氧≧20％，时间为16～24h。

12、所述发酵培养基配方为：葡萄糖1.0％-1.5％、可溶性淀粉2.2％-3.8％、硫酸镁0.05％-0.09％、硫酸铵0.1％-0.3％、氯化钠0.01％-0.03％、磷酸二氢钾0.5％-1.0％、硫酸亚铁0.005％-0.01％、氯化钙0.01％-0.05％，聚醚消泡剂0.05％，余量的水，ph 7.0-7.2。

13、一些具体实施例中，所述微生物菌剂为固体制剂或液体制剂，其制备方法包括如下步骤(1)～(3)或(1)～(4)：

14、(1)菌种活化：将保存于4℃的保藏编号为cgmccno.24314的大青湖黄金杆菌菌种取出，置于室温下活化4-10h，由于菌种保藏于试管斜面营养琼脂培养基上；

15、(2)液体种子制备：在无菌操作台中，取10ml无菌水加入菌种保藏管内，并利用移液器反复吹打制备菌悬液，然后将菌悬液接种至50-500ml液体lb培养基中，振荡培养15-20h，培养条件为：温度25-37℃，振荡转速50-170rpm；

16、(3)高密度发酵：将大青湖黄金杆菌液体种子按体积比1％-5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体发酵；发酵条件：无菌空气保持罐压0.02-0.05mpa，温度25-37℃，转速200-300rpm，溶解氧≧20％，培养时间为16-24h，得到液体菌剂；

17、(4)步骤(3)获得的液体菌剂进行吸附、干燥、粉碎，得到固体菌剂，其有效活菌数108cfu/g以上。

18、按照本发明以上方法制得的固体微生物菌剂，其有效活菌数达108cfu/g以上。在使用前先对固体微生物菌剂进行活化，所述活化具体为：按照固体菌剂:水＝1:3-10的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌活化12-20h。进一步的，所述水中还包括葡萄糖2-4％，硫酸铵0.03-0.06％和磷酸二氢钾0.02-0.05％。

19、本发明还提供了所述的大青湖黄金杆菌、所述的微生物菌剂或所述的制备方法制得的微生物菌剂，在降解废水、废气和土壤中的二氯甲烷中的应用。

20、本发明研究发现，所述菌株yjy22-05对初始浓度为2000mg/l的二氯甲烷24h降解率99.53％，将含有该菌株的菌剂应用于含二氯甲烷废水的生化处理，二氯甲烷初始浓度5535.20mg/l，投加固体菌剂万分之一，48h后体系中二氯甲烷浓度降至4.26mg/l。结果表明，本发明所述的菌株yjy22-05及其制得的微生物菌剂对二氯甲烷具有显著的降解作用。

21、本发明还提供一种降解废水、废气或土壤中的二氯甲烷的方法，将所述的大青湖黄金杆菌、所述的微生物菌剂或所述的制备方法制得的微生物菌剂加入到废水、废气或土壤中。

22、按照废水中有效活菌菌量≥105cfu/ml的量添加所述大青湖黄金杆菌或所述微生物菌剂；

23、按照土壤中有效活菌菌量≥106cfu/g的量添加所述大青湖黄金杆菌或所述微生物菌剂，

24、按照废气中有效活菌菌量≥106cfu/ml的量添加所述大青湖黄金杆菌或所述微生物菌剂。

25、本发明具体实施方案中，对废水进行处理，处理条件优选为：转速50-180rpm，温度25-37℃，ph 5.0-8.0，溶氧1-8mg/l。溶解氧过高不利于菌种分裂繁殖，应用过程中溶解氧过高还会将好氧池活性污泥打碎，不利于菌剂附着，同时还会伴随浮泥、跑泥，导致整个生化系统瘫痪。

26、本发明提供的大青湖黄金杆菌yjy22-05对二氯甲烷具有显著的降解能力，可应用于化工行业含二氯甲烷废水的生物法治理中。该菌株对初始浓度为2000mg/l的二氯甲烷24h降解率99.53％，将该菌剂应用于含二氯甲烷废水的生化处理，二氯甲烷初始浓度5535.20mg/l，投加固体菌剂万分之一，48h后体系中二氯甲烷浓度降至4.26mg/l。应用该菌株能够减轻二氯甲烷对生化处理体系的冲击，提高含二氯甲烷废水的治理效率，具有显著的经济和环保效益。同时，可将该菌株应用于二氯甲烷污染废水及土壤的治理领域。

27、生物保藏说明

28、yjy22-05，分类命名：大青湖黄金杆菌chryseobacterium daecheongense，于2022年1月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.24314。