一种荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.光动力治疗(pdt)因其具有可重复性、低毒性、无创性、不易产生耐药性等优点在抗肿瘤领域备受关注。然而，传统的光敏剂因聚集导致荧光猝灭(acq)效应，不仅导致光敏剂荧光猝灭，而且在疾病组织的高浓度富集状态下活性氧产生能力降低，严重影响pdt效果。与传统的acq光敏剂不同，具有扭曲结构的聚集诱导发光(aie)特性的光敏剂在聚集体状态下的荧光和活性氧(ros)产量均有所提高，非常有利于pdt应用。
3.虽然aie光敏剂有诸多优势，但是大多数aie光敏剂并不一定只局限于靶向病变组织，aie光敏剂在皮肤和非恶性组织的非特异性摄取也会导致光毒性损伤。此外，由于aie光敏剂在体内一直处于“开机”状态，所以接受pdt治疗的癌症患者需要长时间远离光线，以避免治疗后的不良光毒性。
4.近年来，肿瘤微环境(tme)触发的光敏剂又被称为激活型光敏剂，因其对细胞内缺氧、微酸性、过表达的蛋白和高浓度谷胱甘肽(gsh)等特定微环境的可控响应而受到广泛关注。即使在光线照射下，这些光敏剂也保持着安全性。只有在特异性肿瘤微环境区域，荧光和ros的产生才可以恢复，这可在一定程度上避免光敏剂对正常组织的光损伤。
5.由于癌细胞中糖酵解和质膜质子泵的活性增强，从而加速了乳酸的生成，因此肿瘤组织间ph值(ph＝6.5～6.8)通常低于正常组织(ph 7.4)。利用肿瘤环境的酸性条件来调节光敏剂的光敏活性，是提高pdt安全性的常用手段。
6.目前大多数ph激活光敏剂是利用ph响应的包覆剂对光敏剂进行包覆，制备成纳米粒子，在酸性条件下响应释放药物。但是光敏剂本身在酸性或者正常的生理ph都存在光毒性，一旦光敏剂发生泄露，对正常组织也会产生光毒性。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和应用，本发明提供的荧光探针无需包覆ph响应的包覆剂，能够在光照下对肿瘤组织进行杀伤而对于正常组织有较高的安全性，且兼具ph响应、蛋白质结合能力、光动力抗癌活性以及聚集诱导发光特性。
8.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.本发明提供了一种荧光探针，具有式i所示结构：
[0010][0011]
本发明提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
将具有式ii所示结构的化合物、路易斯酸催化剂和有机溶剂混合，进行脱甲基反应，得到具有式iii所示结构的中间产物；
[0013][0014]
将所述中间产物、五氟碘苯、咪唑-4-甲酸、氧化亚铜、无机碱和有机溶剂混合，在保护气氛中进行亲核取代反应，得到式i所示结构的荧光探针。
[0015]
优选的，式ii所示结构的化合物和路易斯酸催化剂的摩尔比为1:(2～4)。
[0016]
优选的，所述脱甲基反应的温度为-20～-10℃。
[0017]
优选的，所述中间产物与所述五氟碘苯的摩尔比为1:(2～3)；所述中间产物和所述咪唑-4-甲酸的摩尔比为1:(0.4～0.6)；所述中间产物和所述氧化亚铜的摩尔比为1:(0.8～1)；所述中间产物和所述无机碱的摩尔比为1:(4～8)。
[0018]
优选的，所述无机碱为碳酸铯。
[0019]
优选的，所述亲核取代反应的温度为70～85℃。
[0020]
优选的，所述路易斯酸催化剂为三溴化硼。
[0021]
本发明提供了一种肿瘤的诊疗试剂，包括上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针。
[0022]
本发明提供了上述技术方案所述荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针在制备光动力抗癌药物中的应用。
[0023]
本发明提供了一种荧光探针，具有式i所示结构。本发明提供的荧光探针具有苯酚基团，由于在酸性和中性条件下苯酚基团结构上的羟基的给电子能力相差悬殊，从而影响荧光探针分子内的能级差，进而影响荧光探针的在酸性和中性条件下活性氧产生能力，能够使所述荧光探针在酸性条件下的活性氧产生能力远高于中性环境，从而能够在光照条件
下，荧光探针受光激发后到达激发单重态，在激发单重态发生系间窜越到达激发三重态，在激发三重态可以发生能量转移给基态的氧气，产生单重态氧，或与周围的生物分子发生电子转移，产生超氧阴离子自由基、羟基自由基等，其中单重态氧、超氧阴离子自由基、羟基自由基等统称为活性氧，这些活性氧可以氧化肿瘤细胞中的蛋白质、dna等，从而杀死癌细胞，实现对具有微酸性特征肿瘤细胞或肿瘤组织进行高效的杀伤而对于正常组织有较高的安全性。同时，本发明提供的荧光探针还具有五氟苯基团，五氟苯基团能够与癌细胞溶酶体上的含有巯基的氨基酸或含有巯基的蛋白质共价偶联，不仅延长荧光探针在肿瘤细胞中的滞留时间，而且能缩短ros与蛋白质底物的作用距离，从而提高肿瘤治疗效果。本发明提供的荧光探针与癌细胞溶酶体上的含有巯基的氨基酸或含有巯基的蛋白质共价偶联后能够进行近红外i区成像，具有聚集诱导发光特性，且本发明提供的荧光探针进行近红外i区成像时具有较大的斯托克斯位移(120nm)，能够有效避免自吸收，降低背景干扰，由此，本发明提供的荧光探针兼具ph响应、蛋白质结合能力以及光动力抗癌活性，能够用于构建兼具诊断与治疗功能于一身的诊疗试剂。
[0024]
本发明提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将具有式ii所示结构的化合物溶解于有机溶剂中，加入路易斯酸催化剂进行脱甲基反应，得到具有式iii所示结构的中间产物；将所述中间产物与五氟碘苯、咪唑-4-甲酸、氧化亚铜、无机碱溶解于有机溶剂中，在保护气氛中进行亲核取代反应，得到式i所示结构的荧光探针。本发明提供的制备方法步骤简单，易于操作，适合工业化生产
附图说明
[0025]
图1为30μm的dpbc-5f在不同甲苯体积分数(f
t
)的甲苯/dmso混合溶液(从低到高对应的体积分数依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％)中720nm处的实时荧光强度随不同甲苯体积分数的曲线图；
[0026]
图2为30μm dpbc-5f与1mm的gsh在37℃条件下孵化不同时间的实时荧光强度与初始荧光强度的比值；
[0027]
图3为30μm dpbc-5f在不同ph条件下(从低到高对应的ph值依次为5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0)，在650nm处的实时荧光强度；
[0028]
图4为5μm dpbc-5f与商业的溶酶体染料(lyso-tracker green)的共定位成像图；
[0029]
图5为dpbc-5f对hela细胞的实时荧光成像图以及加入巯基竞争试剂(n-乙基顺丁烯二酰亚胺)之后，dpbc-5f对hela细胞的实时荧光成像图；
[0030]
图6为在不同ph条件下(ph值分别为5.0、6.6、7.4)，不同浓度的dpbc-5f对hela细胞的暗毒性；
[0031]
图7为在不同ph条件下(ph值分别为5.0、6.6、7.4)，不同浓度的dpbc-5f对hela细胞的光毒性；
[0032]
图8为实施例提供的式i所示结构的荧光探针的制备流程图。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种荧光探针，具有式i所示结构：
[0034][0035]
本发明提供的荧光探针能够与癌细胞溶酶体上的含有巯基的蛋白质结合，进行近红外i区荧光成像；所述荧光探针具有较大的斯托克斯位移，能够有效避免自吸收，降低背景干扰；同时，本发明提供的荧光探针在酸性条件下的活性氧产生能力远高于中性环境中的活性氧产生能力，因此该荧光探针可对具有微酸性特征肿瘤细胞或肿瘤组织进行高效的光动力杀伤。此外，由于所述荧光探针可与溶酶体上的蛋白质结合，缩短活性氧与底物的作用距离、延长荧光探针在肿瘤细胞中的滞留时间、提高肿瘤治疗效果。
[0036]
本发明提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0037]
将具有式ii所示结构的化合物、路易斯酸催化剂和有机溶剂混合，进行脱甲基反应，得到具有式iii所示结构的中间产物；
[0038][0039]
将所述中间产物、五氟碘苯、咪唑-4-甲酸、氧化亚铜、无机碱和有机溶剂混合，在保护气氛中进行亲核取代反应，得到式i所示结构的荧光探针。
[0040]
将具有式ii所示结构的化合物、路易斯酸催化剂和有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)混合，进行脱甲基反应，得到具有式iii所示结构的中间产物。
[0041]
本发明对所述具有式ii结构的化合物的来源没有特殊限定，可以采用本领域技术人员公知的方法制备得到，如参考“fusion ofaromatic ring to azoarenes:one-pot access to 5,6-phenanthroliniums for mitochondria-targeted far-red/nir fluorescent probes”(zheng liu,yonghua xian,jingbo lan,yuanyuan luo,weixin ma,and jingsong you.organic letters，2019,21,1037-1041)制备得到。
[0042]
在本发明中，所述第一有机溶剂优选为能够溶解具有式ii结构的化合物和所述路易斯酸催化剂的非质子性溶剂，保证所述脱甲基反应顺利进行即可，具体如二氯甲烷。
[0043]
在本发明中，所述第一有机溶剂优选为超干有机溶剂。
[0044]
本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊限定，能够使所述脱甲基反应顺利进行即可。
[0045]
在本发明中，所述路易斯酸催化剂具体优选为三溴化硼。
[0046]
在本发明中，式ii所示结构的化合物和路易斯酸催化剂的摩尔比优选为1:(2～4)，更优选为1:3。
[0047]
在本发明中，所述脱甲基反应的温度优选为-20～-10℃，更优选为-20℃。
[0048]
在本发明中，所述脱甲基反应优选在避光条件下进行。
[0049]
在本发明中，具有式ii所示结构的化合物、路易斯酸催化剂和第一有机溶剂的混合进行所述脱甲基反应的具体实施过程优选为：将式ii所示结构的化合物溶解于第一有机溶剂剂中于-20～-10℃条件下避光搅拌30min，得到式ii所示结构的化合物的溶液；将所述路易斯酸催化剂于-20～-10℃条件下加入式ii所示结构的化合物的溶液后避光反应0.5h后再升温至室温避光反应6h。
[0050]
在本发明中，所述脱甲基反应优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定，能够搅拌均匀即可；本发明对所述脱甲基反应的时间没有特殊的限定，本发明优选通过薄层色谱点板(tlc板)对所述脱甲基反应进行监控，反应至具有式ii所示结构的化合物完全消失即可。
[0051]
在本发明中，所述脱甲基反应完成后，本发明优选将所述脱甲基反应的反应液放置至室温，然后加入甲醇猝灭过量的路易斯酸催化剂后，对混合反应液浓缩；将浓缩物进行柱层析，得到具有式iii所示结构的中间产物。
[0052]
在本发明中，所述甲醇与所述脱甲基反应的反应液的体积比优选为(2～4):1，更优为3:1。
[0053]
在本发明中，所述柱层析用洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，其中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为20:1。
[0054]
得到具有式iii所示结构的化合物后，本发明将所述中间产物、五氟碘苯、咪唑-4-甲酸、氧化亚铜、无机碱和有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)混合，在保护气氛中进行亲核取代反应，得到式i所示结构的荧光探针。
[0055]
在本发明中，所述无机碱具体优选为碳酸铯。
[0056]
在本发明中，所述无机碱的作用为所述亲核取代反应提供碱环境。
[0057]
在本发明中，所述咪唑-4-甲酸的作用为与氧化亚铜中的亚铜离子形成配合物，催化所述亲核取代反应。
[0058]
在本发明中，所述氧化亚铜作为所述亲核取代反应的催化剂。
[0059]
在本发明中，所述第二有机溶剂具体优选为乙腈。
[0060]
在本发明中，所述中间产物与所述五氟碘苯的摩尔比为1:(2～3)，更优选为1:(2.1～2.9)。
[0061]
在本发明中，所述中间产物和所述咪唑-4-甲酸的摩尔比优选为1:(0.4～0.6)，更优选为1:(0.41～0.55)。
[0062]
在本发明中，所述中间产物和所述氧化亚铜的摩尔比优选为1:(0.8～1)，更优选为1:(0.83～0.95)。
[0063]
在本发明中，所述中间产物和所述无机碱的摩尔比优选为1:(4～8)，更优选为1:
(4.5～7.5)。
[0064]
在本发明中，所述亲核取代反应的温度优选为70～85℃，更优选为80℃。本发明对所述亲核取代反应的时间没有特殊的限定，优选通过tlc板对所述亲核取代反应进行监控，反应至所述中间产物物完全消失即可。本发明对所述亲核取代反应中的保护气氛没有特殊限定，在常规的保护气氛中进行即可，如氮气氛围、惰性气体氛围。
[0065]
在本发明中，所述亲核取代反应完成后，本发明优选将所述亲核取代反应得到反应液进行后处理，得到式i所示结构荧光探针的纯品。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：
[0066]
将所述亲核取代反应得到反应液依次进行抽滤、浓缩，得到浓缩物；
[0067]
将所述浓缩物进行柱层析，得到具有式i所示结构的荧光探针。
[0068]
在本发明中，所述柱层析用洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为20:1。
[0069]
柱层析完成后，本发明优选将柱层析产物中的溶剂去除，得到具有式i所示结构的荧光探针。本发明对所述溶剂去除的方式没有特殊限定，采用常规的去除溶剂的方式即可，如旋蒸。
[0070]
本发明提供了一种肿瘤的诊疗试剂，包括上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针。
[0071]
本发明提供的肿瘤的诊疗试剂包括所述荧光探针，本发明提供的肿瘤的诊疗试剂中荧光探针能够对癌细胞进行特异性的荧光成像，而对正常细胞不具备荧光成像能力。本发明优选通过静脉注射上述技术方案所述的荧光探针，能够使患者癌症部位呈现出荧光，完成癌症诊断后，本发明优选立即通过在荧光部位进行光照，所述荧光探针产生活性氧，对癌细胞杀死并清除掉，完成治疗。
[0072]
本发明提供了上述技术方案所述荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针在制备光动力抗癌药物中的应用。
[0073]
在本发明中，肿瘤优选为人宫颈癌。
[0074]
本发明提供了一种荧光成像试剂或试剂盒，包括包括上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针。
[0075]
本发明提供的荧光探针(记为dpbc-5f)兼具ph响应、蛋白质结合能力以及光动力抗癌活性，所述荧光探针在溶液态荧光较弱，形成聚集态后会产生强荧光，是典型的aie发光分子；本发明提供的荧光探针在600nm的激发光照射下能够产生720nm的荧光，具有近红外一区发光特性；本发明提供的荧光探针具有苯酚基团，由于酚羟基在酸性和中性条件下给电子能力悬殊，从而影响荧光探针的活性氧产生能力，在酸性条件下的活性氧产生能力高于正常的生理ph条件下的活性氧产生能力；dpbc-5f还具有五氟苯基团，可与巯基氨基酸或者巯基蛋白质共价偶联，不仅使荧光探针的信号增强，还缩短了活性氧与底物的作用距离，延长荧光探针在细胞中的滞留时间，进一步提高肿瘤治疗效果；因此，本发明提供的荧光探针兼具ph响应、蛋白质结合能力以及光动力抗癌活性的荧光探针，具有广阔的应用前景，能够开发为兼具肿瘤诊断与治疗功能于一身的光诊疗试剂。
[0076]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0077]
实施例1
[0078]
按照图8所述的制备流程合成式i所示结构的荧光探针：
[0079]
将式ii所示结构的化合物(图8中的化合物1，472.1mg，1.0mmol)溶于超干的二氯甲烷中，避光放置在-20℃条件下搅拌30min，得到式ii所示结构的化合物的溶液；用长针头注射器取3ml bbr3(原浓度：1.0mol/l，3.0mmol)，在-20℃条件下缓慢加入(滴加)到式ii所示结构的化合物的溶液中，bbr3溶液滴加完毕后，将反应液在-20℃条件下避光反应0.5h后再升温至室温避光反应6h。反应完毕，加入甲醇猝灭多余的bbr3，浓缩后，用硅胶柱层析法进行纯化，所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1)，然后将所得柱层析产物中的溶剂旋干，得到紫黑色固体产物，经计算产率为90％；
[0080]
对所得固体产物进行核磁表征，结果如下：
[0081]1h nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝11.91(s,1h),10.72(s,1h),9.36(d,j＝8.6hz,1h),9.15(dd,j＝16.4,8.3hz,1h),8.53(s,1h),8.30-8.14(m,1h),7.99(t,j＝17.5hz,4h),7.84(s,3h),7.66(s,1h),7.34-7.13(m,1h),7.07(d,j＝19.8,1h),6.90(d,j＝8.3hz,1h).精确分子量为365.1285，hr-ms分子量为：365.1300。
[0082]
根据上述表征数据可知，所得固体产物为化为式iii所示结构的中间产物(图8中的化合物2)；
[0083]
将中间产物(图8中的化合物2，444.1mg，1.0mmol)溶于乙腈溶液中，加入五氟碘苯(881.9mg，3.0mmol)，碳酸铯(2.607g，8.0mmol)，氧化亚铜(71.5mg，0.4mmol)，咪唑-4-甲酸(88.9mg，0.8mmol)。在氮气保护下，放置在80℃中反应24h。反应完毕，抽滤除去固体，浓缩后，用硅胶柱层析法进行纯化，所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1)，然后将所得柱层析产物中的溶剂旋干，得到墨绿色固体产物，经计算产率为35％；
[0084]
对所得墨绿色固体产物进行核磁表征，结果如下：
[0085]1h nmr(500mhz,cdcl3):δ＝8.40(dd,j＝9.6,2.9hz,1h),8.25(dd,j＝8.5,5.7hz,1h),7.89(d,j＝2.1hz,1h),7.79-7.71(m,1h),7.60(dt,j＝10.0,3.8hz,4h),7.54(dtd,j＝9.5,7.6,1.8hz,2h),7.8(dd,j＝13.7,4.3,2h),7.10(d,j＝8.50hz,1h),7.05(d,j＝8.8hz,1h),6.47(dd,j＝15.2,2.1hz,1h).精确分子量为531.1126，hr-ms分子量为：531.1130。
[0086]
根据上述表征数据可知，所得墨绿色固体为式1所示结构的荧光探针(记为dpbc-5f)：
[0087]
[0088]
性能测试：
[0089]
(1)荧光探针的aie性质测定：在不同甲苯体积分数(f
t
)的甲苯/二甲基亚砜混合溶液中分别加入dpbc-5f的甲苯溶液(1mm)，得到浓度为20μm的dpbc-5f溶液，分别测定不同甲苯体积分数的混合溶液中dpbc-5f在720nm的实时荧光强度随不同甲苯体积分数的曲线图，如图1所示(从低到高对应的甲苯的体积分数依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％，激发光波长为600nm)。
[0090]
从图1可以看出，随着甲苯体积分数的增大，dpbc-5f的荧光强度逐渐增强，说明dpbc-5f具有aie特性。
[0091]
(2)dpbc-5f与gsh的响应测试：在浓度为10mm的pbs中加入dpbc-5f，使其最终浓度为30μm，随后加入gsh，使其最终浓度为1mm。将其放置在37℃的水浴锅中孵化不同时间，测试其荧光光谱，分析在720nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值，如图2所示。
[0092]
从图2可以看出，随着孵化时间的延长，实时荧光强度与初始荧光强度的比值逐渐增大，在15min左右即可达到饱和，说明dpbc-5f可与gsh响应。
[0093]
(3)dpbc-5f与ph响应测试：将30μm dpbc-5f加入不同ph的缓冲溶液中(ph值依次为5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0)，测试其荧光光谱，分析在650nm处的实时荧光强度随ph的变化曲线，如图3所示。
[0094]
从图3可以看出dpbc-5f的实时荧光强度随着ph值增大而减小，说明dpbc-5f可对不同ph发生响应。
[0095]
(4)dpbc-5f的共定位成像：将hela细胞铺在共聚焦皿中培养过夜，在细胞中加入5μm的dpbc-5f，孵化30min，用pbs清洗3遍，再加入100nm的溶酶体商业染料(lyso-tracker green)孵化10min，用pbs清洗3遍，再加入新鲜培养基，在激光共聚焦荧光显微镜下观察，拍摄细胞的激光共聚焦图，如图4所示。
[0096]
从图4中可以看出dpbc-5f的红色荧光信号与溶酶体商业染料的绿色信号有较高的重叠度，因此dpbc-5f有溶酶体的定位能力。
[0097]
(5)dpbc-5f与蛋白质结合成像：在hela细胞中加入5μm的dpbc-5f作为空白对照组，孵化30min，再用pbs清洗3遍；在hela细胞中先加入1mm的n-乙基顺丁烯二酰亚胺(nem)与细胞内的巯基化合物或者巯基蛋白质结合，孵化30min，用pbs清洗3遍，再加入5μm的dpbc-5f作为实验组，用pbs清洗3遍，再加入新鲜培养基，在激光共聚焦荧光显微镜下观察，拍摄细胞的激光共聚焦图，如图5所示。
[0098]
从图5中可以看出空白对照产生了明显的荧光信号，而加入nem的实验组基本上没有荧光信号，因此dpbc-5f可与溶酶体上的巯基蛋白质结合，从而产生荧光信号。
[0099]
(6)高钾缓冲溶液的配制：用蒸馏水配制含125mm kcl、20mm nacl、0.5mm cacl2、0.5mm mgcl2、5mm葡糖糖的20mm hepes的缓冲溶液，再用稀盐酸或者氢氧化钠稀溶液调至所需的ph。
[0100]
(7)不同ph条件下dpbc-5f对hela细胞的毒性测试：
[0101]
取对数生长期的细胞，以104细胞/孔的密度接种于96孔板，放置在二氧化碳培养箱中(37℃，5％co2)培养24h。随后，用含有不同浓度dpbc-5f的无血清培养基替换原来的培养基，进一步孵育8h。分别在ph值为5.0、6.6、7.4的高钾缓冲液加入尼日利亚菌素，使其最终浓度为5μg/ml，替代原来的培养基，孵育15min。
[0102]
暗毒性组：置于黑暗条件下30min，再用无血清培养基替代高钾缓冲溶液进一步孵育4h。
[0103]
光毒性组：用15mw/cm2的白光光照30min，再用无血清培养基替代高钾缓冲溶液进一步孵育4h。
[0104]
取出96孔板，在孔中加入10μl cck-8孵化1h。每一组试验留一个孔不加cck-8当成空白孔。最后用酶标仪在450nm波长下测定产物的吸光度。结果表示为处理后的细胞相对于未处理的对照组细胞的活细胞百分比。相对细胞活力按以下公式1计算：
[0105]
细胞活力(％)＝(od
sample-od
background
)/(od
control-od
background
)
×
100％
ꢀꢀꢀ
公式1。
[0106]
从图6和图7的测试结果可以看出，在黑暗条件下，dpbc-5f以及传统光敏剂孟加拉玫瑰红(rb)在不同ph条件下对hela细胞均具有较高的安全性；而在光照条件下，且ph值为5.0、6.6、7.4时，rb对hela细胞都具有较高的杀伤，因此rb光敏剂即使在正常的生理条件下仍具有较高的毒副作用。与之不同的是，在光照条件下，dpbc-5f处理的hela细胞在正常的生理ph条件下仍有较高的存活率，因此dpbc-5f有望提高对于患者的安全性。
[0107]
综上所述，本发明提供的兼具ph响应、蛋白质结合能力以及光动力抗癌活性的荧光探针具有聚集诱导发光特性，能够选择性的定位细胞中的亚细胞器溶酶体；具有较大的斯托克斯位移(120nm)，能够有效避免自吸收，降低背景干扰；同时，本发明提供的荧光探针在酸性条件下的产生的活性氧远高于在正常的生理ph值中产生的活性氧，在光照下，可对具有微酸性特征的肿瘤组织实现高效的杀伤，降低了荧光探针对于正常组织的损伤；此外，由于dpbc-5f可与溶酶体上的蛋白质结合，光照下直接破坏溶酶体上的蛋白质，不仅缩短了活性氧与底物的作用距离，还延长了荧光探针在细胞内的滞留时间，提高了肿瘤治疗效果，可用于制备兼具诊断与治疗于一身的诊疗试剂。
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尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。