一种高效RNA多重靶向建库方法及试剂盒与流程

本发明属于基因测序技术，具体地，本发明涉及一种高效rna多重靶向建库方法以及用于所述rna建库的试剂盒。

背景技术：

1、目前常见的rna检测技术rt-pcr每管检测的核酸标志物数量极为有限，通常只有1-3个，严重制约了rna检测的临床应用方向。特别是针对一些稀有样本，rna标志物的分子数极少，只有个位数，一旦样本分管检测，会极大的降低检测灵敏度。

2、随着高通量测序技术的不断发展，基于全转录组的rna-seq的研究技术及应用也在不断发展。目前rna-seq用于研究与rna相关的多种生物学问题，包括rna结构、空间转录学、全转录组、融合基因检测，病原微生物检测等。

3、当前较为常用的rna建库方法包括用超声或mg2+将rna打断到一定长度的片段，然后用随机引物或加尾后用oligo dt引物逆转录合成第一链，再合成cdna二链，末端修复及加a，纯化，pcr扩库等步骤，此种建库方法步骤繁琐，耗时耗力，检测灵敏度低，难以满足rna-seq应用需求的发展，尤其不能满足液态活检领域融合基因的检测以及rna病毒的高灵敏度检测等方面的应用。因此，亟需开发一种灵敏、快速、简便的rna多重靶向建库技术，以适应rna测序技术在液态活检领域的应用。

4、单引物线性扩增建库技术(opera，one-primer amplification，专利申请号：201910897689.5)对于小片段核酸分子具有极佳的检测灵敏度，同时在多重扩增上具有均一性好、特异性高的优势。可适用于rna逆转录生成的cdna分子的检测，对于液体样本中的小片段rna分子扩增具有极佳的检测效率。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术课题

2、鉴于基因测序技术领域对rna建库技术高效快速简便的需求，本发明的目的是提供一种新的rna建库方法，该建库方法将一步法cdna二链生成技术与单引物线性扩增建库技术(opera技术，详见申请号为201910897689.5的中国专利)相结合，简化了建库过程，提高了建库效率，特别是提高了对于短片段rna分子的检测能力。

3、解决技术课题的技术方案

4、本发明提供一种高效rna建库方法，所述方法包括以下步骤：1)用多重特异性rt引物对片段化rna样本进行逆转录和二链生成反应，得到包含目标区域的双链cdna逆转录产物；2)通过多重线性扩增引物与上述步骤1)生成的包含目标区域的双链cdna第二链互补结合，进行线性扩增，得到线性扩增产物；3)向线性扩增产物中加入连接酶和接头，得到连接产物；4)将连接产物进行pcr扩增，得到rna测序文库。

5、本发明的rna建库方法中，所述线性扩增引物结合于捕获同一目标区域的逆转录rt引物的3’端，所述特异性rt引物与所述线性扩增引物重叠的碱基数小于等于10bp，优选小于等于6bp，更优选小于等于4bp。

6、本发明的rna建库方法中，优选所述线性扩增引物为seq id no.6-10所示的序列。所述线性扩增引物的使用浓度为20～200nm。

7、本发明的rna建库方法中，优选所述特异性rt引物具有seq id no.1-5和seq idno.26-37任一项所示的序列，优选为seq no.1-5和seq no.26-29任一项所示的序列。

8、本发明的rna建库方法中，还包括对扩增产物和rt产物进行纯化的步骤，纯化方法选自磁珠纯化、硅胶柱纯化。所述磁珠优选链霉亲和素磁珠。

9、本发明的rna建库方法中，所述连接酶为单链连接酶，优选为t4rna连接酶或热稳定性rna连接酶；

10、和/或，所述接头包括能够被测序系统识别的通用序列、样本标签序列、分子标签序列中的一种或多种的组合。

11、本发明还提供一种用于rna建库的试剂盒，所述试剂盒包括：逆转录活性dna聚合酶，特异性rt引物、线性扩增引物、dna聚合酶、单链连接酶以及单链接头。

12、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述逆转录活性dna聚合酶具备5’-3’dna聚合酶活性、逆转录活性及5’-3’外切酶活性。

13、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述单链接头优选包含分子标签。

14、本发明的用于rna建库的试剂盒中，还包括dntp、扩库引物、磁珠、缓冲液中的一种或多种。所述dntp为包含生物素标记的dntp。

15、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述线性扩增引物3’末端核苷酸含有二象性功能基团，所述二象性功能基团选自氢原子、c3spacer基团、c6spacer基团、磷酸基团或氨基基团。

16、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述分子标签序列为含6-10个随机碱基的序列中的一种或多种。

17、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述特异性rt引物具有seq id no.1-5或seqid no.26-37任一项所示的序列。

18、本发明的用于rna建库的试剂盒中，所述缓冲液根据需要选择，例如可以是氯化镁、三羟甲基氨基甲烷等常规的缓冲液。

19、本发明还提供一种用于识别特征序列的生物信息分析方法，所述分析方法主要包括以下步骤：

20、1)对根据上述方法或试剂盒获得的rna样本建库进行测序，将测序获得的fastq数据进行去除通用接头序列处理，得到去除通用接头序列后的clean-fastq数据；

21、2)与人类基因转录组参考序列进行比对，得到比对文件；

22、3)利用工具软件进行融合基因的信息的提取，获得融合基因的分析结果。

23、所述工具软件例如可以是arriba(2.1.0版本)、rna fusion analysis软件等。

24、有益的技术效果

25、与传统的rna建库技术相比，本发明的rna建库方法和试剂盒通过将一步法cdna二链生成技术与单引物线性扩增建库技术相结合，简化了rna建库过程、提高了rna建库效率，特别是提高了对于短片段rna分子的检测能力，尤其适合目前快速发展的液态活检技术对特征rna分子的检测需求。

技术特征：

1.一种rna多重靶向建库方法，所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的rna多重靶向建库方法，所述线性扩增引物结合于同一目标区域的特异性rt引物的3’端，所述特异性rt引物与所述线性扩增引物重叠的碱基数小于等于10bp，优选小于等于6bp，更优选小于等于4bp。

3.如权利要求1或2所述的rna多重靶向建库方法，所述线性扩增引物具有seq idno.6-10任一项所示的序列；

4.如权利要求1或2所述的rna多重靶向建库方法，所述连接酶为单链连接酶，优选为t4rna连接酶或热稳定性rna连接酶；

5.如权利要求1或2所述的多重靶向rna建库方法，还包括对逆转录产物和扩增产物进行纯化的步骤，所述纯化方法选自磁珠纯化和硅胶柱层析；

6.一种用于rna多重靶向建库的试剂盒，所述试剂盒包括：逆转录活性dna聚合酶、特异性rt引物、特异性线性扩增引物、单链连接酶以及单链接头。

7.如权利要求6所述的试剂盒，所述逆转录活性dna聚合酶具备5’-3’dna聚合酶活性、逆转录活性及5’-3’外切酶活性。

8.如权利要求6所述的试剂盒，还包括rnase h、dntp、扩库引物、磁珠、缓冲液中的一种或多种。

9.如权利要求6或7所述的试剂盒，所述线性扩增引物3’末端核苷酸含有二象性功能基团，所述二象性功能基团选自氢原子、c3spacer基团、c6spacer基团、磷酸基团或氨基基团。

10.如权利要求6或7所述的试剂盒，所述单链接头包含能够被测序系统识别的通用序列、样本标签序列、分子标签序列中的一种或多种，优选所述分子标签为含6～10个随机碱基的序列中的一种或多种。

11.一种用于识别特征序列的生物信息分析方法，所述分析方法主要包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种高效RNA多重靶向建库方法，所述方法包括以下步骤：1)用多重特异性RT引物对片段化RNA样本进行逆转录和cDNA二链生成反应，得到包含目标区域的双链cDNA逆转录产物；2)通过多重线性扩增引物与上一步骤生成的包含目标区域的双链cDNA第二链互补结合，进行线性扩增，纯化后得到单链线性扩增产物；3)向单链线性扩增产物中加入连接酶和接头，得到连接产物；4)将连接产物进行PCR扩增，得到RNA测序文库。本发明的RNA多重靶向建库方法将一步法cDNA二链生成技术与单引物线性扩增建库技术相结合，简化了多重靶向建库过程，提高了建库效率，特别是提高了对于短片段RNA分子的检测能力。

技术研发人员：杨国华,郭志伟,余佳佳,车彬
受保护的技术使用者：羿鸣（苏州）诊断技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4