一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒及其用法的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤指一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒及其用法。

背景技术：

1、副流感病毒(piv)属副粘病毒科，副粘病毒亚科。piv根据基因型和抗原性的不同可分为4个不同型，分别为piv1型～piv-4型，piv1型和piv-3型属于呼吸道病毒属，piv-2型和piv-4型属于腮腺炎病毒属。piv1型～piv-4型是引起人类(尤其是在婴幼儿中)上下呼吸道感染的重要病原体，是婴儿与幼年儿童呼吸道的重要病原体，6个月以内婴儿肺炎和细支气管炎的第二位常见病原体。引起感冒症状如：发烧、喉咙痛等。导致反复感染的下呼吸道疾病，如肺炎、支气管炎和细支气管炎，特别是在婴幼儿、老年人和有免疫缺陷人群中。许多其他的呼吸道病毒包括鼻病毒、流感病毒、偏肺病毒等感染引起的症状与副流感病毒的症状类似，难以明确区分，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快速诊断呼吸道病毒感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒、抗细菌药物提供依据，并在避免滥用抗生素方面具有重要意义。本试剂盒用于定性检测上、下呼吸道样本中副流感病毒1、2、3、4型核酸。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒及其用法。在同一反应管中同时对副流感病毒1、2、3、4亚型进行特异性快速、便捷、高效的方法进行分型快速检测，时对扩增体系增加了内质控，监控采样和核酸提取，并具有良好的灵敏度和特异性。

2、本发明提供了一种引物探针组合物，包括选自如下的引物探针组：

3、用于检测副流感病毒1型的引物探针组a，所述引物探针组a包括seq id no.1所示的上游引物，seq id no.2所示的下游引物，seq id no.3所示的探针；

4、用于检测副流感病毒2型的引物探针组b，所述引物探针组b包括seq id no.4所示的上游引物，seq id no.5所示的下游引物，seq id no.6所示的探针；

5、用于检测副流感病毒3型的引物探针组c，所述引物探针组c包括seq id no.7所示的上游引物，seq id no.8所示的下游引物，seq id no.9所示的探针；

6、用于检测副流感病毒4型的引物探针组d，所述引物探针组d包括seq id no.10所示的上游引物，seq id no.11所示的下游引物，seq id no.12所示的探针。

7、在一个实施方式中，引物探针组合物还包括内标引物探针组e，包括seq id no.13所示的上游引物，seq id no.14所示的下游引物，seq id no.15所示的探针。

8、在一个实施方式中，所述副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型以及内标的特异性探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自fam、vic、rox、tamra或cy5；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3和dabcyl中的任意一种或几种。

9、本发明还提供一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括如上述所述的引物探针组合物。

10、在一个实施方式中，所述试剂盒还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和空白对照。

11、具体的，所述阳性对照包括副流感病毒1、2、3、4型假病毒和人胚肾细胞293t混合液；所述阴性对照为人胚肾细胞293t培养液；所述空白对照为无核酸酶水。

12、在一个实施方式中，所述核酸扩增反应液还包括：tris缓冲液、钾离子、硫酸铵、镁离子、da/g/c/utps、四甲基氯化铵(tmac)、海藻糖、二甲基亚砜(dmso)。

13、在一个实施方式中，所述核酸扩增反应液中，所述特异性引物seq id no.1-2，seqid no.4-5，seq id no.7-8，seq id no.10-11和seq id no.13-14的浓度为350-450nm，所述特异性探针seq id no.3，seq id no.6，seq id no.9和seq id no.12的浓度为150-250nm，所述内源性内标引物探针seq id no.15的浓度均为75-125nm。

14、在一个实施方式中，所述核酸扩增反应液中tris缓冲液的浓度为20-40mm，ph为8.8、钾离子的浓度为20-40mm、硫酸铵的浓度为20-40mm、镁离子的浓度为4-6mm、da/g/c/utps的浓度为0.2-0.6mm、四甲基氯化铵的浓度为20-40mm、海藻糖的浓度为0.32％-0.64％、二甲基亚砜的浓度为0.2％-0.8％。

15、在一个实施方式中，所述酶混合液包括：逆转录酶、热启动dna聚合酶、rna酶抑制剂、udg酶和牛血清白蛋白。

16、本发明还提供一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

17、pcr反应液准备：根据待扩增样本数n，按核酸扩增反应液和酶混合液11:1.5的比例分别配制pcr反应液，充分混匀后分装至pcr反应容器中；

18、样本处理及加样：对样本进行核酸提取，提取好的待测样本、阳性对照、阴性对照和空白对照核酸溶液分别取与上述配制pcr反应容器中等体积的液体加入到pcr反应容器反应液中，密封反应容器后，离心后备用；

19、pcr扩增检测：将pcr反应容器放入实时荧光pcr扩增仪进行扩增检测；

20、结果判断：试剂盒中的检测靶标对应的阴性对照、阳性对照以及试剂盒中的内参基因检测同时满足要求时，进行检测样本的阴阳性判断。

21、具体的，所述pcr扩增检测的程序如下：

22、

23、与现有技术相比，本发明提供的一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒及其用法的实施方式至少具有以下有益效果：

24、1、本发明提供一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，在1管中实现分型鉴别，同时对试剂体系进行内控，可以监控副流感病毒的流行趋势和流行型别；

25、2、本发明试剂盒中的引物探针组合，其检测通量、灵敏度和特异性均较好；

26、3、本发明提供一种配合试剂实现快速扩增的程序，使检测时长可控制在1小时内，在大规模副流感病毒筛查过程中，明显提高筛查效率。

技术特征：

1.引物探针组合物，其特征在于，包括选自如下的引物探针组：

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合物还包括内标引物探针组e，包括seq id no.13所示的上游引物，seq id no.14所示的下游引物，seq idno.15所示的探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型以及内标的特异性探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自fam、vic、rox、tamra或cy5；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3和dabcyl中的任意一种或几种。

4.一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括如权利要求1-3所述的引物探针组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶混合液、阳性对照、阴性对照和空白对照。

6.根据权利要求4所述的一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增反应液还包括：tris缓冲液、钾离子、硫酸铵、镁离子、da/g/c/utps、四甲基氯化铵(tmac)、海藻糖、二甲基亚砜(dmso)。

7.根据权利要求5一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增反应液中，所述特异性引物seq id no.1-2，seq id no.4-5，seq id no.7-8，seq idno.10-11和seq id no.13-14的浓度为350-450nm，所述特异性探针seq id no.3，seq idno.6，seq id no.9和seq id no.12的浓度为150-250nm，所述内源性内标引物探针seq idno.15的浓度均为75-125nm。

8.根据权利要求5一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增反应液中tris缓冲液的浓度为20-40mm，ph为8.8、钾离子的浓度为20-40mm、硫酸铵的浓度为20-40mm、镁离子的浓度为4-6mm、da/g/c/utps的浓度为0.2-0.6mm、四甲基氯化铵的浓度为30-70mm、海藻糖的浓度为0.32％-0.64％、二甲基亚砜的浓度为0.2％-0.8％。

9.根据权利要求5所述的一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括：逆转录酶、热启动dna聚合酶、rna酶抑制剂、udg酶和牛血清白蛋白。

10.一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种用于副流感病毒快速分型检测试剂盒及其用法，本发明提供一种区分副流感病毒分型鉴别试剂，在1管中实现，可以监控副流感病毒的流行趋势和流行型别；引物探针组合，其检测通量、灵敏度和特异性均较好；快速扩增程序，使检测时长可控制在1小时内，在大规模副流感病毒筛查过程中，明显提高筛查效率。

技术研发人员：李丹,董晋涛,杜赞花,金捷
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5