一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法与流程

1.本发明涉及保健品技术领域，具体为一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法。


背景技术：

2.蜂王浆是由6～12日龄工蜂头部的王浆腺(舌腺和鄂腺)分泌，用于喂养饲喂蜂王及幼虫的特殊乳浆状物质，又名蜂乳、皇浆。蜂王浆含有丰富的蛋白质，其中主要水溶性蛋白。此外，王浆含游离脂肪酸达26种以上，以10-羟基-2-癸烯酸(10-hda)最为重要，也是王浆特有的成分。具有抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长等多种功效，是国际上长期以来评价王浆质量的重要指标。王浆对于更年期女性缓解更年期综合征具有良好的效果，但也有报道女性长期服用蜂王浆或蜂王浆冻干粉会导致女性子宫内膜增厚。随着社会经济的发展，现代女性的生育年龄呈现逐步增长的趋势，大龄和高龄产妇越来越多，生育障碍人群也越来越多，很多生育障碍与女性因为年龄增大子宫孕育能力下降有很大关系。通过对蜂王浆的加工和开发，如果能开发出对于更年期女性更适用，副作用更小；对于大龄和高龄女性生育有帮助作用的产品具有重要的市场价值和前景
3.传统的蜂王浆蛋白的纯化方法主要有透析、多种层析分离方法叠加组合等，不仅耗时、费力而且成本高、收率低，难以满足生物学研究所需，也不适合规模化生产。10-hda的提取方法主要有以乙醇、乙醚或乙酸乙酯为溶剂的传统提取法、溶液沉淀结晶法、醇中沉淀结晶法、高效液相色谱法及大孔树脂分离法等。其中，传统提取法，例如采用乙酸乙酯为溶剂的提取方法，工序繁琐，操作不易，通常需要耗时数个小时以上，提取率低。沉淀结晶法操作复杂，耗时长，整个提取过程通常需要20多个小时。高效液相色谱法成本高，不适合工业化生产。大孔树脂分离法所消耗溶剂量过大，并且提取过程通常需要10个小时以上，耗时长。在提取10-had的方法中不可避免的会导致蛋白结构的改变而使得蛋白变性。
4.因此，现有分离蛋白的技术中无法分离10-hda，分离10-hda方法中蛋白结构被破坏导致活性蛋白变性，无法实现同时的分离提取，这是本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，以解决现有技术中存在的问题。
6.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，其特征在于，主要包括以下分离提纯步骤：分散、二次过滤、活性蛋白的提取、脂肪酸的提取。
7.作为优化，包括以下提取步骤：
8.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和有机溶剂按质量比1：4～1：8混合均匀，在氮气氛围中，20～30℃，300～500r/min搅拌20～30min，制得分散液；
9.(2)二次过滤：将步骤(1)制得的分散液用滤网过滤，取初次沉淀物，同时收集滤液，将初次沉淀物和有机溶剂按质量比1：4～1：8混合均匀，在氮气氛围中，20～30℃，300～
500r/min搅拌20～30min，再次用滤网过滤，得到二次沉淀物，同时收集合并滤液；
10.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的二次沉淀物加入二次沉淀物质量8～10倍的混合溶液中，在室温下，100～300r/min搅拌提取20～30min，将搅拌提取得到的提取液用滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用混合溶液洗涤3～5次，在1～10pa，-10～-1℃的条件下干燥6～8h，制得活性蛋白；
11.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液进行旋转蒸馏，得到蒸馏产物，将蒸馏产物和无水乙醇按质量比1：4～1：8混合均匀，在20～30℃，300～500r/min搅拌20～30min，在-20～-16℃静置1～2h，过滤，并在1～10pa，-10～-1℃的条件下干燥6～8h，制得10-羟基-2-癸烯酸。
12.作为优化，步骤(1)所述蜂王浆冻干粉是由新鲜蜂王浆冻干而成。
13.作为优化，步骤(1)、(2)所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、正己烷中的一种或多种混合。
14.作为优化，步骤(2)、(3)所述滤网为400～800目滤网。
15.作为优化，步骤(3)所述异丙醇水溶液为质量分数60～80％的异丙醇水溶液。
16.作为优化，步骤(4)所述旋转蒸馏的条件为：压力-0.08～-0.06mpa，温度45～50℃。
17.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
18.本发明在分离提取蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的时，先将蜂王浆冻干粉和有机溶剂混合成分散液，进行二次过滤得到二次沉淀物和滤液，用异丙醇对二次沉淀物洗涤过滤并干燥制得活性蛋白，将滤液旋转蒸馏，再用乙醇重结晶制得10-羟基-2-癸烯酸。
19.首先，本技术提供一种使用王浆冻干粉作为提取原料从蜂王浆中提取10-羟基-2-癸烯酸有机酸的方法，同时由于蛋白的二级结构外层亲水，内腔疏水的特性，在冻干的王浆干粉中所选择的有机溶剂不能溶解蛋白和进入蛋白内腔中，有效的保护了蛋白的结构不被破坏，在提取10-hda的同时保持了蛋白的活性。该方法实现了提取10-hda和保持王浆中蛋白活性，操作方便，成本低，大大缩短工艺周期。
附图说明
20.下面结合附图，通过对本技术的具体实施方式详细描述，将使本技术的技术方案及其它有益效果显而易见。
21.在附图中：
22.图1是不同药物对薄子宫内膜模型大鼠e2(a)、p4(b)水平的影响图。
具体实施方式
23.下面将结合图1和发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中制作的活性蛋白和脂肪酸的各指标测试方法如下：
25.薄型子宫大鼠模型动物实验
26.建立薄型子宫内膜大鼠模型，利用阴道细胞涂片法、放射免疫分析、he染色、免疫组化等实验探究rj、mrj、10-hda对薄型子宫内膜大鼠模型的作用。
27.实验药物：戊酸雌二醇片、王浆冻干粉(rj)、王浆蛋白产物(mrj)、含癸烯酸脂溶性(hda)。
28.实验动物：性成熟未交配雌性sd大鼠，8周龄；体重220
–
250g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物合格证号：scxk(苏)2022-0010，饲养于22
±
2℃的环境中，自由摄食和饮水。
29.实验分组
30.control组：雌性sd大鼠每日灌胃给等体积生理盐水，连续灌胃15天(n＝6)。
31.model组：手术造模后，sd大鼠正常饲养，每日灌胃等体积生理盐水，连续灌胃15天(n＝6)。
32.rj组：手术造模后，sd大鼠每日灌胃rj，给药剂量为500mg/kg，给药体积为1ml/100g，连续灌胃15天(n＝6)。
33.mrj组：手术造模后，sd大鼠每日灌胃mrj，给药剂量为500mg/kg，给药体积为1ml/100g，连续灌胃15天(n＝6)。
34.hda组：手术造模后，sd大鼠每日灌胃hda，给药剂量为500mg/kg，给药体积为1ml/100g，连续灌胃15天(n＝6)。
35.mp组：手术造模后，sd大鼠每日灌胃mp，给药剂量为0.3mg/kg，给药体积为1ml/100g，连续灌胃15天(n＝6)。
36.在动情期大鼠在子宫左角注射95％乙醇，右角注射生理盐水。然后用rj(500mg/kg体重)、mrj(500mg/kg体重)、hda(500mg/kg体重)或mp(0.3mg/kg体重)每天治疗一次，持续15天。
37.实施例1
38.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，所述蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法主要包括以下制备步骤：
39.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和丙酮按质量比1：4混合均匀，在氮气氛围中，20℃，300r/min搅拌30min，制得分散液；
40.(2)二次过滤：将步骤(1)制得的分散液用400目滤网过滤，取初次沉淀物，同时收集滤液，将初次沉淀物和丙酮按质量比1：4混合均匀，在氮气氛围中，20℃，300r/min搅拌30min，再次用400目滤网过滤，得到二次沉淀物，同时收集合并滤液；
41.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的二次沉淀物加入二次沉淀物质量8倍的质量分数60％异丙醇水溶液中，在室温下，100r/min搅拌提取30min，将搅拌提取得到的提取液用400目滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用质量分数60％异丙醇水溶液洗涤3次，在1pa，-10℃的条件下干燥8h，制得活性蛋白；
42.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液在-0.08mpa，45℃的条件下旋转蒸馏，得到蒸馏产物，将蒸馏产物和无水乙醇按质量比1：4混合均匀，在20℃，300r/min搅拌30min，在-20℃静置2h，过滤，并在1pa，-10℃的条件下干燥8h，制得10-羟基-2-癸烯酸。
43.实施例2
44.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，所述蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法主要包括以下制备步骤：
45.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和乙酸乙酯按质量比1：6混合均匀，在氮气氛围中，25℃，400r/min搅拌25min，制得分散液；
46.(2)二次过滤：将步骤(1)制得的分散液用600目滤网过滤，取初次沉淀物，同时收集滤液，将初次沉淀物和乙酸乙酯按质量比1：6混合均匀，在氮气氛围中，25℃，400r/min搅拌25min，再次用600目滤网过滤，得到二次沉淀物，同时收集合并滤液；
47.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的二次沉淀物加入二次沉淀物质量9倍的质量分数70％异丙醇水溶液中，在室温下，200r/min搅拌提取25min，将搅拌提取得到的提取液用600目滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用质量分数60～80％异丙醇水溶液洗涤4次，在5pa，5℃的条件下干燥7h，制得活性蛋白；
48.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液在-0.07mpa，48℃的条件下旋转蒸馏，得到蒸馏产物，将蒸馏产物和无水乙醇按质量比1：6混合均匀，在25℃，400r/min搅拌25min，在-18℃静置1.5h，过滤，并在5pa，-5℃的条件下干燥7h，制得10-羟基-2-癸烯酸。
49.实施例3
50.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，所述蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法主要包括以下制备步骤：
51.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和正己烷按质量比1：8混合均匀，在氮气氛围中，30℃，500r/min搅拌20min，制得分散液；
52.(2)二次过滤：将步骤(1)制得的分散液用800目滤网过滤，取初次沉淀物，同时收集滤液，将初次沉淀物和正己烷按质量比1：8混合均匀，在氮气氛围中，30℃，500r/min搅拌20min，再次用800目滤网过滤，得到二次沉淀物，同时收集合并滤液；
53.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的二次沉淀物加入二次沉淀物质量10倍的质量分数80％甘油水溶液中，在室温下，300r/min搅拌提取20min，将搅拌提取得到的提取液用800目滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用质量分数80％甘油水溶液洗涤5次，在10pa，-1℃的条件下干燥6h，制得活性蛋白；
54.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液在-0.06mpa，50℃的条件下旋转蒸馏，得到蒸馏产物，将蒸馏产物和无水乙醇按质量比1：8混合均匀，在30℃，500r/min搅拌20min，在-16℃静置1h，过滤，并在10pa，-1℃的条件下干燥6～8h，制得10-羟基-2-癸烯酸。
55.对比例1
56.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，所述蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法主要包括以下制备步骤：
57.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和乙酸乙酯按质量比1：6混合均匀，在氮气氛围中，25℃，400r/min搅拌25min，制得分散液；
58.(2)过滤：将步骤(1)制得的分散液用600目滤网过滤，取沉淀物，同时收集滤液；
59.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的沉淀物加入沉淀物质量9倍的质量分数70％异丙醇水溶液中，在室温下，200r/min搅拌提取25min，将搅拌提取得到的提取液用600目滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用质量分数60～80％异丙醇水溶液洗涤4次，在5pa，5℃的条件下干燥7h，制得活性蛋白；
60.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液在-0.07mpa，48℃的条件下旋转蒸馏，得到蒸馏产物，将蒸馏产物和无水乙醇按质量比1：6混合均匀，在25℃，400r/min搅拌25min，在-18℃静置1.5h，过滤，并在5pa，-5℃的条件下干燥7h，制得10-羟基-2-癸烯酸。
61.对比例2
62.一种蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法，所述蜂王浆中活性蛋白和脂肪酸的分离提取方法主要包括以下制备步骤：
63.(1)分散：将蜂王浆冻干粉和乙酸乙酯按质量比1：6混合均匀，在氮气氛围中，25℃，400r/min搅拌25min，制得分散液；
64.(2)二次过滤：将步骤(1)制得的分散液用600目滤网过滤，取初次沉淀物，同时收集滤液，将初次沉淀物和乙酸乙酯按质量比1：6混合均匀，在氮气氛围中，25℃，400r/min搅拌25min，再次用600目滤网过滤，得到二次沉淀物，同时收集合并滤液；
65.(3)活性蛋白的提取：将步骤(2)获得的二次沉淀物加入二次沉淀物质量9倍的质量分数70％异丙醇水溶液中，在室温下，200r/min搅拌提取25min，将搅拌提取得到的提取液用600目滤网过滤，弃去滤液，上层固体重复用质量分数60～80％异丙醇水溶液洗涤4次，在5pa，5℃的条件下干燥7h，制得活性蛋白；
66.(4)脂肪酸的提取：将步骤(2)获得的滤液在-0.07mpa，48℃的条件下旋转蒸馏，制得10-羟基-2-癸烯酸。
67.效果例
68.下表1给出了采用本发明实施例1～3和对比例1～2的活性蛋白的纯度和10-羟基-2-癸烯酸的纯度的分析结果。
69.表1
[0070][0071]
从表1中实施例1、2、3和对比例1的实现数据比较可发现，实施例1、2、3对比对比例1的活性蛋白纯度高，说明了进行二次过滤有效的对活性蛋白进行分离提纯，从而提高了活性蛋白的纯度；从实施例1、2、3和对比例2的实现数据比较可发现，实施例1、2、3对比对比例2的10-羟基-2-癸烯酸纯度高，说明了进一步用乙醇重结晶可以有效的提高10-羟基-2-癸烯酸的纯度。
[0072]
图1为不同药物对薄子宫内膜模型大鼠e2、p4水平的影响。动情期大鼠在子宫左角注射95％乙醇，右角注射生理盐水。然后用rj(500mg/kg体重)、mrj(500mg/kg体重)、hda(500mg/kg体重)或mp(0.3mg/kg体重)每天治疗一次，持续15天。第4(b)段。结果以平均值
±
标准差(n＝6)表示*p《0.05，**p《0.01。从图1可知，和control组比，model组大鼠血清e2、p4
含量显著下降；和model组比，rj、hda、mp组大鼠血清e2、p4含量显著上升。
[0073]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。