一种肺结核感染诊断标志物及其诊断试剂盒的制作方法

1.本发明属于肺结核诊断和治疗技术领域，尤其涉及一种肺结核感染诊断标志物及其诊断试剂盒中的应用。


背景技术：

2.肺结核是一种具有久远历史的慢性传染病，其实一个重大的全球性公共卫生问题，严重威胁着人类健康。因此，对肺结核进行及时准确的诊断，不仅能够使患者尽早得到针对性治疗进而改善预后，更重要的是能够使传染源得到及时有效的可知，避免肺结核的传播，然而由于肺结核的临床表现多样，因此影像学表现缺乏足够的特异性，实验室也缺乏理想的生物学指标，致使肺结核的诊断至今仍然困扰这临床医务工作者。
3.非编码rna是指不具备蛋白质编码能力的rna，包括转运rna、核糖体rna、小核仁rna以及非编码rna。非编码rna广泛参与生命活动中重要的生物功能，如生物个体的发育与分化、生殖、细胞凋亡和细胞重编程等，并且其与人类疾病密切相关。
4.长链非编码rna具有广泛的组织表达谱，与编码蛋白质的mrna相比，他们的表达丰度一般较低，但却具有更强的组织和细胞表达特异性。因此，长链非编码rna具有成为生物标志物的潜力。故，本发明对长链非编码rna在肺结核诊断中的应用进行研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种肺结核感染诊断标志物及其诊断试剂盒，从而让使用者可以更加快速和有效的诊断患者是否患有肺结核以及患者的预后情况。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了检测linc01148基因表达的引物在制备辅助诊断肺结核感染的试剂盒中的应用。
7.优选地，所述linc01148基因的转录本序列为seq id no.1。
8.优选地，所述引物的上游序列为seq id no.2，所述引物的下游序列为seq id no.3。
9.其次，本发明提供了检测linc01148基因表达的引物在制备诊断肺结核感染患者预后的试剂盒中的应用。
10.优选地，所述linc01148基因的转录本序列为seq id no.1。
11.优选地，所述引物的上游序列为seq id no.2，所述引物的下游序列为seq id no.3。
12.其次，本发明提供了linc01148基因的sirna在制备肺结核治疗药物中的应用。
13.优选地，所述linc01148基因的转录本序列为seq id no.1；所述sirna的正义链的序列为seq id no.4；所述sirna的反义链的序列为seq id no.5。
14.优选地，所述药物通过抑制巨噬细胞中结核杆菌存活来治疗肺结核；
优选地，所述巨噬细胞为thp-1细胞；优选地，所述结核杆菌为结核杆菌h37rv。
15.其次，本发明提供了linc01148基因的sirna在制备抑制巨噬细胞中结核杆菌存活的药物中的应用。
16.优选地，所述linc01148基因的转录本序列为seq id no.1；所述sirna的正义链的序列为seq id no.4；所述sirna的反义链的序列为seq id no.5。
17.本发明的有益效果是：本发明通过对比健康对照组和肺结核患者的外周血单个核细胞中linc01148基因的表达差异发现linc01148基因在肺结核患者中表达量升高，同时本发明发现治愈后的患者外周血单个核细胞中linc01148基因的表达量相较于未治疗的患者下降，且差异均具有优异的特异性和灵敏度。因此，可以将linc01148基因用于诊断肺结核和肺结核患者的预后诊断。
18.同时，本发明发现结核杆菌感染巨噬细胞后linc01148基因的表达量同样出现上调，并且抑制linc01148基因表达可以有效的抑制巨噬细胞中结核杆菌的活性，因此可将linc01148基因的抑制剂用于治疗肺结核。
附图说明
19.图1为不同分组之间linc01148基因相对表达量的差异；图2为健康治疗组和未治疗组之间的roc曲线；图3为未治疗组和初步治疗组之间的roc曲线；图4为未治疗组和治愈组之间的roc曲线；图5为thp-1细胞感染结核杆菌后linc01148的表达量差异；图6为本发明提供的linc01148-sirna对于thp-1细胞中linc01148表达量的抑制效果；图7为抑制linc01148后结核杆菌在thp-1细胞中的存活情况。
具体实施方式
20.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
21.研究对象选取青岛市中心医院收治的肺结核患者，分为：未治疗组42例，初步治疗组（治疗3月的患者）30例，治愈组25例，同时，选取40例健康对照。各组在年龄，性别上没有显著差异。
22.肺结核患者诊断纳入标准符合肺结核诊断标准，排除标准为患有慢性肝炎、hiv、高血压、糖尿病、肿瘤等疾病的患者。
23.实施例1提取各分组的cdna（1）清晨空腹采集研究对象外周血5ml于肝素钠抗凝管中，混匀备用；
（2）使用ficoll淋巴细胞分离液，按照密度梯度离心法分离获得单个核细胞，pbs冲洗3次；（3）在单个核细胞中加入1ml trizol试剂，使用移液枪吹打混匀后，放置5min；（4）加入200μl氯仿，颠倒混匀后，室温下静置5min，12000rpm离心15min；（5）小心的将上层水相转移至新的无酶离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置10min；（6）12000离心10min，弃去上清，加入500μl预冷的70%乙醇溶解沉淀，8000rpm离心5min，弃去上清，室温干燥5-10min，加入30μl depc水，即得到rna。
24.（7）参照天根生物逆转录试剂盒配置如下gdna去除反应体系：组成成分
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
使用量5
×
gdnabuffer2μltotalrna2μgrnase-freeddh2o补足到10μlgdna的反应条件为：42℃， 3min，之后4℃放置；（8）逆转录反应体系组成成分使用量10
×
kingrtbuffer2μlfastkingrtenzymemix1μlfq-rtprimermix2μl步骤（7）反应液10μlrnase-freeddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5μl逆转录反应的反应条件为：42℃ 孵育15min，95℃ 孵育3min，4℃保存。
25.实施例2检测linc01148基因在不同分组中的表达差异1.根据linc01148的转录本序列（seq id no.1）设计loc1053773056基因的上下游引物：linc01148上游引物：ctctgtcacccaagctggag，seq id no.2；linc01148下游引物：ggtgcatgcctgtagttcca，seq id no.3；2.配置如下反应体系
试剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
使用量hieff
®
qpcrsybrgreen mastermix (lowroxplus)10μl模板dna1μlforward primer0.5μlreverse primer0.5μl无菌超纯水8μl
设置如下反应步骤：预变性 95℃ 5min；变性 95℃ 10s，退火/延伸60℃ 30s 40个循环。
26.3. 采用2
‑△△
ct
方法处理实时定量pcr数据，计算linc01104的表达变化，实验结果如图1所示。
27.实验得到的结果被展示于图1中。其中，未治疗组的相对表达量为2.988
±
1.034，相较于健康对照组的表达量升高，且p＜0.05，差异具有统计学意义；初步治疗组的相对表达量为1.840
±
0.783，表达量低于未治疗组，且p＜0.05，差异具有统计学意义；治愈组的相对表达量为1.089
±
0.582，表达量进一步降低，且p＜0.05，差异具有统计学意义；上述结果说明患有肺结核的患者的外周血单个核细胞中的linc01104基因的表达量明显高于健康个体，而患者治疗后，单个核细胞中linc01104基因的表达量则出现明显下降。
28.实施例3绘制各组之间的roc曲线1.健康对照组和未治疗组的roc曲线如图2所示，其auc值为0.966，其置信区间为0.936-0.997，其cut-off值为1.958，其灵敏度为83.3%，其特异度为97.5%，上述结果说明将linc01148作为标志物来诊断患者是否感染肺结核时，具有优异的诊断价值。
29.2.未治疗组和初步治疗组的roc曲线如图3所示，其auc值为0.820，我置信区间为0.718-0.922，其cut-off值为1.820，其灵敏度为73.3%，其特异度为85.7%；3.未治疗组和治愈组的roc曲线如图4所示，其auc值为0.955，其置信区间为0.913-0.997，其cut-off值为2.013，其灵敏度为95.5%，其特异度为83.3%，上述结果说明将linc01148作为标志物来诊断患者肺结核预后时，具有优异的诊断价值。
30.实施例4结核杆菌杆菌感染对于巨噬细胞中linc01148基因表达的影响（1）选择细胞状态良好，形态规则，呈透亮圆球形的thp-1细胞接种于培养板中，使用100ng/ml的pma诱导24h使其变成巨噬细胞并使细胞贴壁；（2）将h37rv按照moi=10:1进行细胞感染，加菌4h后，弃去上清，使用pbs清洗3次并换液，此时记录为感染0h；（3）分别提取感染0h和感染24h的细胞rna，rna提取方法，逆转录和荧光定量检测步骤同实施例1和2，每组设置有5个重复，结果如图5所示。
31.实验得到的结果被展示于图5中，可以看出，感染24h后，巨噬细胞thp-1细胞中的linc01148基因的相对表达量显著升高（相对表达量为5.52
±
0.0512），差异具有统计学意义。
32.实施例5设计和检测抑制linc01148基因的sirna（1）根据linc01148的转录本序列设计sirna，设计的sirna（linc01148-sirna）如下:正义链：ggaagaacugauauauuuaca，seq id no.4；反义链：uaaauauaucaguucuuccug，seq id no.5；nc-sirna由上海吉玛公司提供；（2）将thp-1细胞接种于培养板中，使用100ng/ml的pma诱导24h使细胞贴壁；（3）利用lip3000转染linc01148-sirna和nc-sirna，同时设置一个空转lip3000的
对照组；（4）转染48h后，提取rna，检测linc01148的相对表达量。
33.实验得到的结果被展示于图6中，可以看出，本发明所提供的linc01148-sirna可以有效的抑制thp-1细胞中linc01148的表达量，其抑制率84.7%。
34.实施例6抑制linc01148基因对于结核杆菌在巨噬细胞中生存增殖的影响（1）将thp-1细胞接种于培养板中，使用100ng/ml的pma诱导24h使细胞贴壁；（2）利用lip3000转染linc01148-sirna和nc-sirna；（3）转染48h后将h37rv按照moi=10:1进行细胞感染，加菌4h后，弃去上清，使用pbs清洗3次并换液，此时记录为感染0h；（4）分别在感染0h和24h用0.05% sds 裂解感染的细胞， 经过 10 倍梯度稀释， 按照稀释比例接种在含有 10% oadc 的 7h10 琼脂平板上， 并在 37℃ 孵育 3周计数cfu。
35.实验得到的结果被展示于图7中，可以看出，相较于对照组，转染了linc01148-sirna的thp-1细胞中结核杆菌的菌量明显下降，说明使用linc01148-sirna可以有效的抑制结核杆菌在巨噬细胞内的存活。
36.实施例7 检测肺结核感染的诊断试剂盒本发明提供了一种检测肺结核感染的诊断试剂盒，该试剂盒包括检测linc01148表达量的引物和 sybr green 染料，无菌水，dntp。
37.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。