基于中国汉纳酵母降解展青霉素的用途

1.本发明属于毒素降解技术领域，具体涉及基于中国汉纳酵母降解展青霉素的用途。


背景技术：

2.展青霉素又被称为棒曲霉素，是一种毒性极强的聚酮类次级代谢产物，其化学式为c7h6o4，分子量为154.13。展青霉素是一种白色结晶，熔点110.5-112℃，易溶于低ph水和乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂，ph 3.3-5.5水溶液中的展青霉素即使在105℃-125℃高温环境下仍比较下稳定，而在碱性条件下不稳定，最大紫外吸收波长为276nm，展青霉素能耐受105-125℃的高温。
3.青霉属中有13种真菌能够产生展青霉素，扩展青霉是展青霉素的主要产生菌，其产展青霉素的最佳温度20-25℃。20世纪初，展青霉素因能抑制超过75种不同细菌而作为一种广谱抗生素被报道。进一步临床研究发现，展青霉素对真菌和动植物细胞都有毒性作用。展青霉素的毒性主要表现为急性毒性、慢性毒性和细胞毒性，同时，它还是癌症发生的潜在促进者。鉴于展青霉素对人和动物的强烈毒性，美国、欧盟和中国等许多国家或组织都对食品中展青霉素含量制定了严格的限定标准，我国也与国际标准接轨，对苹果、山楂及其制品中的展青霉素含量做出了严格的限定标准。
4.目前控制展青霉素污染的方法主要有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要采用人工采选、高压水冲洗、冷藏、过滤和吸附、巴氏消毒、以及辐射等措施对产品中的展青霉素进行处理，但物理方法需要大量的人力、物力，成本高，而且有些方法会影响产品品质。化学方法控制展青霉素主要分为两种：一是通过化学杀菌剂从根源上杀灭病原菌从而防止展青霉素污染；二是通过添加化学物质清除已产生的展青霉素。但是，添加化学物质需要深入了解其反应机制，反应产物是否有毒性等，而且有些化学物质会严重破坏产品品质，导致营养和产品价值丧失。
5.生物防治方法是指利用有活性的拮抗菌(酵母菌)抑制病原菌的生长从而控制展青霉素的产生或者通过微生物发酵直接清除已经产生的展青霉素。近年来，采用微生物及其产生的酶降解毒素成为研究的热点，虽然已有的酵母菌、乳酸菌和霉菌被发现具有降解展青霉素的功效，但是面临效果不佳，降解缓慢的问题；而且目前降解展青霉素的酵母菌较少，目前也没有关于中国汉纳酵母控制展青霉素的相关报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的缺陷与不足；本发明提供一株分离自生态果园土壤的中国汉纳酵母(hannaella sinensis)，基于中国汉纳酵母降解展青霉素，其具有高安全性和极高的降解效果。
7.本发明所提供的降解展青霉素的中国汉纳酵母菌株是从镇江市世业洲农业生态果园的土壤中筛选分离到的，在nyda固体培养基平板上28℃培养，进行形态学观察；对该菌
株的26srrna d1/d2区序列分析，进行分子生物学鉴定；鉴定为中国汉纳酵母(hannaella sinensis)yd，并且已经通过对icr小鼠进行毒性经口试验，证明其安全性，对人体无害。同时，本发明所提供的降解展青霉素的中国汉纳酵母菌株现保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2021年7月5日，保藏编号为：cctcc no:m 2021821，建议的分类命名为中国汉纳酵母(hannaella sinensis)yd。此外，本发明所利用的菌株申请人已经申请中国发明专利且已公开，发明名称为：一株控制苹果采后病害的酵母菌及其用途。
8.为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
9.(1)配制菌悬液：将中国汉纳酵母接入nydb培养基中，在25～28℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于nyda固体培养基，培养温度25～28℃，时间48-72h；然后，挑选nyda固体培养基生长的中国汉纳酵母单菌落接种到nydb培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗数次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成1
×
108cells/ml的菌悬液；
10.(2)取步骤(1)制备的菌悬液，接种于nydb培养基中，再取展青霉素标准品溶液加入nydb培养基中，在避光环境下，震荡培养，即可实现快速降解展青霉素的用途。
11.优选的，步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min，时间为10min，温度为4℃。
12.优选的，步骤(1)中所述的nyda培养基成分如下：以1000ml计，牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，余量为蒸馏水，115℃湿热灭菌15min。
13.优选的，步骤(1)中所述的nydb培养基成分如下：以1000ml计，酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，余量为蒸馏水，ph自然，115℃灭菌15min。
14.优选的，步骤(1)中所述单菌落接种到nydb培养基中进行培养的温度为25℃～28℃，时间为48h。
15.优选的，步骤(1)中所述用无菌蒸馏水清洗数次具体为2～3次。
16.优选的，步骤(2)中所述菌悬液接种于nydb培养基中的接种量为1％～2％；即菌悬液为nydb培养基体积的1％～2％。
17.优选的，步骤(2)中所述nydb培养基中展青霉素标准品的终浓度为10μg/ml。
18.优选的，步骤(2)中所述震荡培养的条件为：25℃，180rpm，时间12～30h。
19.本发明的优点：
20.(1)本发明提供中国汉纳酵母的胞内酶可以高效快速降解展青霉素；在ota初始浓度为10μg/ml，在12h的降解率接近50％，18h降解率达到80％左右，30h后实现完全降解，降解效果十分显著。
21.(2)本发明使用的中国汉纳酵母，经小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，因此可应用于控制食品，饲料及其制品等中的展青霉素污染，保障食品，饲料及其制品等的食用安全性。
附图说明
22.图1为中国汉纳酵母对展青霉素的降解效果图；其中：ck：用无菌水处理的对照组；y：用中国汉纳酵母处理的实验组。
具体实施方式
23.通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明；以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
24.实施例1：
25.(1)配制菌悬液：将中国汉纳酵母接入nydb培养基中，在25℃、180rpm震荡条件下，培养24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于nyda固体培养基，培养温度25℃，时间48h；然后，挑选2环nyda固体培养基生长的中国汉纳酵母单菌落，接种到50ml的pm培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗3次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成1
×
108cells/ml的菌悬液；
26.(2)取步骤(1)制备的菌悬液，按照1％的添加量接种于nydb培养基中，然后再加入展青霉素标准品溶液，使其在nydb培养基中的浓度为10μg/ml，在25℃、180rpm震荡条件下，避光培养；
27.取样检测：从0h开始，每间隔6h取样，经7000
×
g离心10min，再用0.22μm有机滤膜过滤，测定展青霉素的降解效果；
28.对照组：对照组与实施例1的步骤(2)操作一致，区别是将步骤(2)中的菌悬液替换为无菌水。
29.利用hplc测定其展青霉素含量：高效液相色谱法测定展青霉素含量，液相系统为安捷伦1260(agilent technologies，usa)，色谱柱为zorbax sb-c
18
柱(250mm
×
4.6mm，5μm，agilent)。流动相为水和乙腈(90:10，v/v)，流速1.0ml/min，检测温度28℃，进样量20μl，检测时间15min，检测波长为276nm。
30.检测结果如图1所示，中国汉纳酵母对展青霉素有明显的降解作用，在ota初始浓度为10μg/ml，在12h的降解率接近50％，18h降解率超过80％，在培养30小时后，接种了中国汉纳酵母的nydb培养基中展青霉素的浓度下降到仪器的最低检测限。然而，对照组中展青霉素的浓度在30小时内没有明显下降；这表明中国汉纳酵母细胞在展青霉素的降解中发挥了重要作用，能快速降解展青霉素。
31.综上所述，中国汉纳酵母对展青霉素具有显著的降解效果，并且以其制备的菌悬液或生防制剂可广泛用于果蔬或果汁领域展青霉素的降解。
32.说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。