一种己二胺的全细胞生物合成方法

本发明涉及一种己二胺的全细胞生物合成方法，属于生物工程领域。

背景技术：

1、己二胺作为重要的化工原料，在尼龙66的工业生产中具有重要应用。目前己二胺的合成主要依靠己二腈加氢技术。目前，己二腈的制备技术主要包括丁二烯氢氰化法、丙烯腈电解法和己二酸胺化脱水法，其中丁二烯氢氰化法在工业上占比最高。然而，该技术需要挥发性剧毒物氢氰酸的参与，并伴随着不可再生化石燃料的消耗，反应条件苛刻、分离工艺复杂、技术垄断程度高，限制了全球己二腈产能，进而限制了己二胺的产能。随着己二酸市场价格的下跌，通过己二酸氨化脱水合成己二腈也逐渐具备了一定的市场竞争力，但仍存在一些技术缺陷，例如催化剂回收和再生困难、副反应多等问题。

2、近年来，随着化石原料的消耗引起了越来越多的环境问题，以及国际对控制co2排放的重视，各类化学品原料的获取形式正在发生巨大变化。最近已有报道提出，以琥珀酰-coa、4-氨基丁酰-coa、4-氨基丁醛、谷氨酸或2,5-(羟甲基)糠醛为底物，经多级酶联反应可合成己二胺。随着生物基己二酸的发展，以己二酸为底物合成己二胺的途径被开发。生物转化己二酸为己二胺包含两个分支，一是，己二酸首先被羧酸还原为己酸半醛，己酸半醛在转氨酶的作用下转化为6-氨基己酸，6-氨基己酸再经羧酸还原合成6-氨基己醛，最后6-氨基己醛经转氨作用合成己二胺。另一条支路是己二酸直接经过两次连续的羧酸还原反应，合成己二醛，然后己二醛再经两次连续转氨反应合成己二胺。fedorchuk团队利用来源于mycobacteriumchelonae羧酸还原酶mab4714和来源于streptomyces avermitilis转氨酶sav2585构建了己二酸至己二胺的体外合成系统，并用mab4714的突变体(l342e)和来源于大肠杆菌的丁二胺转氨酶pata优化了该反应系统，降低了中间体6-氨基己酸的积累，实现了己二酸至己二胺的一锅法生物催化。然而，该系统建立在生物体外，己二酸底物和多种氨基供体需要外加，原料成本较高，多种纯酶的制备会进一步增加操作成本。微生物细胞工厂能制备丰富的酶系、转化低成本原料(如葡萄糖)为各种氨基酸和辅因子。建立己二胺全细胞生物合成系统将是未来攻克生物基己二胺产业化难题的主要方向。

技术实现思路

1、本发明的目的在于突破目前己二胺的合成技术瓶颈，提供了一种微生物合成己二胺的方法，该方法在大肠杆菌工程菌株中利用羧酸还原酶(car)和转氨酶(ta)异源构建了己二胺生物合成途径(图1)，实现了己二酸至己二胺的全生物转化，包括最初的car-ta己二胺合成系统的构建和进一步优化的car-ta-ta己二胺合成系统的构建，提高了己二酸至己二胺的转化效率。

2、本发明的第一个目的是提供一种产己二胺的基因工程菌，所述基因工程菌过表达羧酸还原酶和转氨酶。

3、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌过表达一种或多种来源于不同的转氨酶。

4、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌过表达一种或两种来源于不同的转氨酶。

5、在本发明的一种实施方式中，所述羧酸还原酶包括来源于mycobacteroidesabscessus的羧酸还原酶mab car。

6、在本发明的一种实施方式中，所述转氨酶包括来源于chromobacteriumviolaceum atcc12472的天冬氨酸转氨酶cvta，来源于e.coli mg1655的丁二胺转氨酶pata，来源于streptomyces avermitilis的4-氨基丁酸转氨酶gabt，来源于hafnia alvei的丁二胺转氨酶hata，来源于solanum tuberosum的4-氨基丁酸转氨酶stta，来源于silicibacter pomeroyi的天冬氨酸转氨酶spta，来源于vibrio fluvialis的丙酮酸转氨酶vfta或来源于paracoccus denitrificans的转氨酶pdta。

7、在本发明的一种实施方式中，所述羧酸还原酶mab car的氨基酸序列如seq idno.1所示，所述转氨酶cvta的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述转氨酶pata的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述转氨酶gabt的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述转氨酶hata的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述转氨酶stta的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述转氨酶spta的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述转氨酶vfta的氨基酸序列如seq id no.8所示，所述转氨酶pdta的氨基酸序列如seq id no.9所示。

8、在本发明的一种实施方式中，所述羧酸还原酶mab car的核苷酸序列如seq idno.10所示，所述转氨酶cvta的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述转氨酶pata的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述转氨酶gabt的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述转氨酶hata的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述转氨酶stta的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述转氨酶spta的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述转氨酶vfta的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述转氨酶pdta的核苷酸序列如seq id no.18所示。

9、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌过表达氨基酸序列如seq id no.1所示的羧酸还原酶mab car和氨基酸序列如seq id no.3所示的转氨酶pata或氨基酸序列如seq id no.5所示的转氨酶hata；

10、或，所述基因工程菌过表达氨基酸序列如seq id no.1所示的羧酸还原酶mab car和氨基酸序列如seq id no.3所示的转氨酶pata或氨基酸序列如seq id no.5所示的转氨酶hata。

11、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌利用prsfduet-1、petduet-1和/或pacycduet-1质粒表达编码羧酸还原酶的基因和编码转氨酶的基因。

12、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌利用prsfduet-1质粒表达编码羧酸还原酶的基因。

13、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌利用petduet-1和/或pacycduet-1质粒表达编码转氨酶的基因。

14、本发明的第二个目的是提供一种己二胺合成方法，所述方法为以己二酸为反应底物，利用上述基因工程菌进行反应得到己二胺。

15、在本发明的一种实施方式中，所说方法为将上述基因工程菌接种于添加有4～8g·l-1葡萄糖的培养基中，35～38℃，225～275r·min-1条件下进行摇瓶发酵3～5h后，添加终浓度为0.1mmol·l-1的iptg诱导并添加2～5g·l-1的己二酸底物。

16、在本发明的一种实施方式中，所述培养基的组分包括10～20g·l-1的胰蛋白胨，5-10g·l-1的酵母提取物，0.5-10g·l-1的氯化钠，0.95g·l-1mgcl2和0.186g·l-1kcl。

17、本发明还提供上述基因工程菌和上述方法在制备含有己二胺的产品中的应用。

18、有益效果：

19、本发明的方法以大肠杆菌为宿主菌株利用羧酸还原酶(car)和转氨酶(ta)异源构建了己二酸至己二胺的生物转化途径。通过引入car-ta-ta系统优化己二胺合成途径各步骤之间的协调性，有效提高己二胺的积累，并且不会进一步累计副产物6-氨基己酸，使得己二胺合成产量显著提高至22mg·l-1。本发明提供了一种通过微生物细胞工厂合成己二胺的方法，具有操作简易、污染少、产品质量高等优点，为未来己二胺合成技术的开发奠定了基础。