1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用花生枯饼固态发酵制备鼠李糖脂的方法。
背景技术：
2.鼠李糖脂是一类主要由铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）合成的糖脂类生物表面活性剂。与化学合成的表面活性剂相比，鼠李糖脂具有高活性、无毒、易降解、生态友好、可以在极端环境中保持活性等优势。随着公众环保意识增强和科技进步，对生物表面活性剂的需求也势必增加。因其相对较好的活性，鼠李糖脂已成为当前研究和应用最热门的生物表面活性剂，在石油工业、环境修复、农业、食品、医药等领域有着广阔应用前景和巨大应用潜力。然而，与化学表面活性剂相比，较高的原料成本和工艺投入导致鼠李糖脂的生产成本较高，严重影响鼠李糖脂生物表面活性剂的大规模推广应用。
3.目前鼠李糖脂主要通过好氧液态发酵生产获得，液态发酵生产过程中通气、搅拌使得已产生的鼠李糖脂以液膜包裹气体产生泡沫，并且随着发酵液中鼠李糖脂浓度的增加而加剧泡沫逃液。泡沫的产生增加发酵染菌概率和鼠李糖脂产物损失，严重影响鼠李糖脂的生产效率。此外，鼠李糖脂液态发酵过程的泡沫控制等工艺进一步增加了鼠李糖脂的生产成本。鼠李糖脂生产的经济性是其商业化生产应用的瓶颈。鼠李糖脂的固态发酵生产可以大大降低的泡沫产生，是一项值得深入研究和探索的鼠李糖脂发酵生产技术。合适的固态营养基质是左右鼠李糖脂固态发酵生产效率的重要因素之一。
4.花生仁榨油后约产生一半甚至三分之二的残渣，即花生枯饼。花生枯饼中含有丰富的营养物质，如多糖、蛋白质、油脂等，可作为微生物生长代谢的碳源和氮源。目前花生枯饼主要用作动物饲料，限制了花生枯饼的髙值转化利用，造成资源的极大浪费。花生枯饼有望成为鼠李糖脂固态发酵生产工艺中廉价易得、性能优良的固态营养基质。
5.利用花生枯饼固态发酵生产鼠李糖脂，既可以实现花生油生产加工副产品的髙值资源化利用，又能达到无泡沫发酵生产鼠李糖脂的效果，并能降低鼠李糖脂的生产成本。
技术实现要素：
6.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种利用花生枯饼固态发酵制备鼠李糖脂的方法。
7.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：一种利用花生枯饼固态发酵制备鼠李糖脂的方法，以花生榨油后的残渣（花生枯饼）为营养底物、以秸秆为支撑物制备固体发酵培养基，利用保藏编号为cgmcc no.21276的铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）通过固态发酵生产鼠李糖脂。
8.上述方法中固体培养基由花生枯饼、秸秆、无机盐水溶液混合搅拌而成，花生枯饼为花生榨油后的残渣，秸秆为小麦秸秆或水稻秸秆，无机盐包括硝酸钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，氯化钙。
9.利用花生枯饼固态发酵制备鼠李糖脂的方法，具体步骤如下：1）固体培养基制备：固体培养基由花生枯饼、秸秆、无机盐水溶液混合搅拌而成，并在115℃灭菌30min。其中花生枯饼、秸秆和无机盐水溶液的比例为2~6kg:0.1~0.5kg:1~3l；秸秆为小麦秸秆或水稻秸秆；无机盐水溶液组成为：硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
10.2）发酵菌种种子液制备。液体种子培养基在115℃灭菌30min，冷却后，将铜绿假单胞菌cgmcc no.21276菌种接种至液体种子培养基中，接种量为2%~10%（v/v），在30~35℃、180rpm条件下培养8~12h，制备发酵菌种的种子液。
11.3）固态发酵：将铜绿假单胞菌cgmcc no.21276的种子液接种到花生枯饼固体培养基中，接种量为2%~10%（l/100kg固体培养基），发酵时间5~8天，发酵温度为30℃~40℃，进行固态发酵生产鼠李糖脂。
12.4）鼠李糖脂的提取：利用氢氧化钠调节蒸馏水的ph至8.0~9.0，然后用作溶剂去浸提固态发酵培养物20~30min，离心收集浸出液，利用盐酸调节浸出液ph至1.5~2.0，经低温静置、离心等过程得到鼠李糖脂。
13.所述方法在花生枯饼资源化利用和鼠李糖脂生产中的应用，所述方法能够将花生枯饼转化为高应用价值的鼠李糖脂生物表面活性剂，通过固态发酵进行鼠李糖脂的无泡沫发酵生产。
14.本发明的有益效果在于：本发明将花生枯饼这一花生榨油后的残渣转化为高应用价值的鼠李糖脂生物表面活性剂，可以用于花生枯饼的髙值资源化利用。本发明以花生枯饼和秸秆作为发酵生产鼠李糖脂的经济性固体基质，可降低鼠李糖脂的生产成本；通过固态发酵工艺还能解决鼠李糖脂发酵生产中的泡沫问题。
15.菌种保藏信息保藏时间：2020年12月1日；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏编号： cgmcc no.21276；保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；分类命名：铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa。
具体实施方式
16.结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可通过商业途径得到。
17.本发明的发酵菌种铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa，已于2020年12月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.21276。
18.实施例1用于固态发酵生产鼠李糖脂的培养基：花生枯饼50g，小麦秸秆5g，无机盐溶液50ml。其中无机盐溶液组成为硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸
镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
19.用于制备种子液的培养基为液态lb培养基：蛋白胨10g/l，，酵母粉 5g/l，nacl 10g/l，余量为水，ph 7.0。
20.用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制相应的培养基；置于115℃下灭菌30min。
21.本实施例中所用发酵菌种为铜绿假单胞菌cgmcc no. 21276。
22.待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取菌种斜面一环，接种到含100ml lb培养基的三角瓶中，铜绿假单胞菌在35℃、180rpm条件下培养10h，制备种子液。
23.然后，将2ml铜绿假单胞菌的种子液接种到固态发酵培养基中在35℃条件下培养6天固态发酵生产鼠李糖脂，每隔8h将三角瓶中的固体培养物进行摇晃翻动。
24.发酵结束后，先利用氢氧化钠溶液调节蒸馏水的ph至8.5，然后用ph为8.5的蒸馏水浸提固态发酵培养物20min，离心收集浸出液；再利用盐酸溶液调节浸出液的ph至2.0，置于4℃下静置6h，离心收集沉淀，75℃烘箱干燥沉淀，得到鼠李糖脂。所得鼠李糖脂纯度为86%。
25.实施例2用于固态发酵生产鼠李糖脂的培养基：花生枯饼50g，小麦秸秆5g，无机盐溶液25ml。其中无机盐溶液组成为硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
26.用于制备种子液的培养基为液态lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉 5g/l，nacl 10g/l，余量为水，ph 7.0。
27.用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制相应的培养基；置于115℃下灭菌30min。
28.本实施例中所用发酵菌种为铜绿假单胞菌cgmcc no. 21276。
29.待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取菌种斜面一环，接种到含100ml lb培养基的三角瓶中，铜绿假单胞菌在35℃、180rpm条件下培养10h，制备种子液。
30.然后，将2ml铜绿假单胞菌的种子液接种到固态发酵培养基中在35℃条件下培养6天固态发酵生产鼠李糖脂，每隔8h将三角瓶中的固体培养物进行摇晃翻动。
31.发酵结束后，先利用氢氧化钠溶液调节蒸馏水的ph至8.5，然后用ph为8.5的蒸馏水浸提固态发酵培养物20min，离心收集浸出液；再利用盐酸溶液调节浸出液的ph至2.0，置于4℃下静置6h，离心收集沉淀，75℃烘箱干燥沉淀，得到鼠李糖脂。所得鼠李糖脂纯度为82%。
32.实施例3用于固态发酵生产鼠李糖脂的培养基：花生枯饼45g，小麦秸秆5g，无机盐溶液15ml。
33.其中无机盐溶液组成为硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
34.用于制备种子液的培养基为液态lb培养基：蛋白胨10g，酵母粉 5g，nacl 10g，补加去离子水至1l，ph 7.0。
35.用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制相应的培养基；置于115℃下灭菌
30min。
36.本实施例中所用发酵菌种为铜绿假单胞菌cgmcc no. 21276。
37.待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取菌种斜面一环，接种到含100ml lb培养基的三角瓶中，铜绿假单胞菌在35℃、180rpm条件下培养10h，制备种子液。
38.然后，将2ml铜绿假单胞菌的种子液接种到固态发酵培养基中在35℃条件下培养6天固态发酵生产鼠李糖脂，每隔8h将三角瓶中的固体培养物进行摇晃翻动。
39.发酵结束后，先利用氢氧化钠溶液调节蒸馏水的ph至8.5，然后用ph为8.5的蒸馏水浸提固态发酵培养物20min，离心收集浸出液；再利用盐酸溶液调节浸出液的ph至2.0，置于4℃下静置6h，离心收集沉淀，75℃烘箱干燥沉淀，得到鼠李糖脂。所得鼠李糖脂纯度为81%。
40.实施例4该实施例对比铜绿假单胞菌cgmcc no. 21276的利用花生枯饼和豆粕固态发酵生产鼠李糖脂的效果。
41.固态发酵生产鼠李糖脂的培养基a：花生枯饼125g，小麦秸秆12.5g，无机盐溶液125ml。其中无机盐溶液组成为硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
42.固态发酵生产鼠李糖脂的培养基b：豆粕125g，小麦秸秆12.5g，无机盐溶液125ml。其中无机盐溶液组成为硝酸钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，磷酸氢二钾7.5g/l，七水硫酸镁1.2g/l，氯化钙0.1g/l，余量为水。
43.用于制备种子液的培养基为液态lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉 5g/l，nacl 10g/l，余量为水，ph 7.0。
44.用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制相应的培养基；置于115℃下灭菌30min。
45.本对比实施例中所用发酵菌种为铜绿假单胞菌cgmcc no. 21276。
46.待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取菌种斜面一环，接种到含100ml lb培养基的三角瓶中，铜绿假单胞菌在35℃、180rpm条件下培养10h，制备种子液。
47.然后，分别将2ml铜绿假单胞菌的种子液接种到固态发酵培养基a（约263g）中，设置3个平行，在35℃条件下培养6天，进行固态发酵生产鼠李糖脂，每隔8h将三角瓶中的固体培养物进行摇晃翻动。发酵结束后，先利用氢氧化钠溶液调节蒸馏水的ph至8.5，然后用ph为8.5的蒸馏水浸提固态发酵培养物20min，离心收集合并浸出液；再利用盐酸溶液调节浸出液的ph至2.0，置于4℃下静置6h，离心收集沉淀，75℃烘箱干燥沉淀，得到鼠李糖脂s1。
48.然后，分别将2ml铜绿假单胞菌的种子液接种到固态发酵培养基b（约263g）中，设置3个平行，在35℃条件下培养6天，进行固态发酵生产鼠李糖脂，每隔8h将三角瓶中的固体培养物进行摇晃翻动。发酵结束后，先利用氢氧化钠溶液调节蒸馏水的ph至8.5，然后用ph为8.5的蒸馏水浸提固态发酵培养物20min，离心收集浸出液；再利用盐酸溶液调节浸出液的ph至2.0，置于4℃下静置6h，离心收集沉淀，75℃烘箱干燥沉淀，得到鼠李糖脂s2。
49.从3瓶固态培养物a中共得到鼠李糖脂1.9g，所得鼠李糖脂纯度为85%。从3瓶固态培养物b中共得到鼠李糖脂0.8g，所得鼠李糖脂纯度为81%。
50.本发明的固态发酵生产鼠李糖脂的方法将花生枯饼这一花生榨油后的残渣转化
为高应用价值的鼠李糖脂生物表面活性剂，可以用于花生枯饼的髙值资源化利用。本发明方法以农产品残渣花生枯饼高产鼠李糖脂，且发酵过程中无泡沫产生，可降低鼠李糖脂的生产成本，并解决鼠李糖脂发酵生产中的泡沫问题。