一种慢病毒载体、其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种慢病毒载体、其制备方法和应用。

背景技术：

1、慢病毒属于逆转录病毒科，与其它逆转录病毒相比，慢病毒既可以感染处于有丝分裂活跃期的细胞，也可以感染处于分裂终末期或分裂缓慢的细胞。此外，慢病毒更倾向于整合到宿主基因组远离转录起始点的位点的非活性转录区域中，其激活原癌基因沉默的风险低于其它逆转录病毒载体。

2、现有技术中，最常见的慢病毒载体(lentivirus vector)是以hiv-1(人类免疫缺陷i型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。hiv-1包含九个关键病毒基因，其中gag基因可以编码病毒所需的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需要的酶，env基因编码病毒的包膜糖蛋白。这三个基因编码结构蛋白和蛋白酶，是保证病毒复制能力的关键基因，并且可以决定病毒感染宿主的靶向性。在病毒表达的过程中还需要一些顺式作用元件，包括长末端重复序列(ltrs)、tat激活区(tar)、剪接供体和受体位点、包装和二聚化信号(ψ)、rev反应元件(rre)以及中央和末端多聚嘌呤区(ppt)等。在两端的ltrs中间插入需要表达的目的基因，将其送入靶细胞之中可实现外源基因的表达。慢病毒的包装容量一般在4.5kb～5kb左右，近年来成为细胞治疗尤其是免疫细胞治疗应用方面的主流载体。

3、体外的慢病毒包装系统经历三代的发展优化，主要目的是最大程度的保证其安全性，这使得将其用于细胞治疗中可能出现的成瘤和致瘤风险大大降低。第一二代慢病毒包装系统是将载体组分成三个质粒，即转移质粒(表达载体质粒)、包膜质粒和包装质粒。转移质粒是指外源插入基因片段置于所需相关顺式作用元件中用于合成包装于病毒颗粒中遗传物质的质粒，包膜质粒是指合成组装病毒膜蛋白(该膜蛋白介导慢病毒感染整合目标靶细胞)的质粒，而包装质粒指的是除了病毒膜蛋白以外其它需要组装慢病毒所需要的病毒基因，第一代包装质粒序列是去除病毒膜蛋白基因、包装信号或/和ltrs的几乎全部的病毒基因组，第二代包装质粒又进一步删掉了附属基因vif、vpu、vpr和nef，以减少产生复制型慢病毒(rcl)的风险。第三代慢病毒包装系统是将包装质粒进一步一分为二，成为四质粒包装系统。这两个包装质粒一个编码rev基因，另一个编码gag和pol基因，包装质粒与任何表达慢病毒载体没有显著同源性，最大程度减少三个基因同时整合的可能性。此外将转移质粒5'ltr的u3启动子区替换为来自cmv或rsv的强病毒启动子构建ta非依赖性的质粒；删除了u3区的3'ltr获得自身失活的慢病毒载体，进一步有效地减少了rcls的风险。可以说，通常情况下三代慢病毒包装系统在临床应用上已经具备足够的安全性。

4、慢病毒是一种有包膜结构的病毒，纯化工艺比较复杂，纯化工艺的选择对慢病毒产品的生产成本、生产时间和质量存在较大影响。如何获得高效的用于工业纯化的慢病毒包装起始材料是实现慢病毒载体生产经济性的一个重大考量。目前，许多研究在转移质粒中引入其它元件以提高产生病毒的转导效率。比如：引入wpre以提高慢病毒的表达和包装效价，引入cppt以促进慢病毒前整合复合物的翻译以及入核参与载体的整合等。然而，现有技术中慢病毒载体生产病毒的转导效率得以的提升的同时存在着感染活性降低的问题。

5、因此，除了安全性和转导效率，作为细胞治疗的重要工具，如何经济的获得高生物活性的慢病毒载体是现在基因治疗和细胞治疗中亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中慢病毒载体生产病毒时难以兼顾转导效率和生物活性的不足之处而提供一种慢病毒载体、其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，其5‘ltr前的启动子为cmv启动子；目的基因前的启动子为嗜淋巴细胞病毒来源的htlv启动子或sffv启动子。

4、本发明基于起始慢病毒表达载体，将5‘ltr前的启动子换成强启动子cmv，将目的基因前的启动子换成了嗜淋巴细胞病毒来源的启动子htlv；或将5‘ltr前的启动子换成强启动子cmv，将目的基因前面的启动子换成了嗜淋巴细胞病毒来源的启动子sffv。所得改造慢病毒载体的感染滴度、功能滴度和物理滴度均显著提高，生物活性高。

5、作为本发明所述的慢病毒载体的优选实施方式，所述cmv启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述htlv启动子的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述sffv启动子的核苷酸序列如seq id no.10所示。

6、第二方面，本发明提供了一种所述慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)将起始慢病毒载体的5‘ltr前的xcm i和xho i酶切位点间基因序列替换为cmv启动子基因序列；

8、(2)将起始慢病毒载体的目的基因前cla i和dra iii酶切位点间基因序列替换为htlv启动子或sffv启动子基因序列，得慢病毒载体；

9、(3)将所得慢病毒载体和辅助质粒共转染宿主细胞，培养、分离，即成。

10、本发明的制备方法简单、便捷，适用于大规模的推广和应用。

11、作为本发明所述的慢病毒载体的优选实施方式，所述起始慢病毒载体为pcdh-ef1-mcs。

12、作为本发明所述的慢病毒载体的优选实施方式，所述cmv启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述htlv启动子的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述sffv启动子的核苷酸序列如seq id no.10所示。

13、作为本发明所述的慢病毒载体的优选实施方式，所述cmv启动子的克隆引物序列如seq id no.2和/或seq id no.3所示；所述htlv启动子的克隆引物序列如seq id no.5和/或seq id no.6所示；所述sffv启动子的克隆引物序列如seq id no.8和/或seq idno.9所示。

14、第三方面，本发明提供了一种慢病毒包装载体系统，包括所述慢病毒载体、包膜蛋白表达质粒、gag-pol表达质粒和rev表达质粒。

15、本发明的慢病毒包装载体系统最高可提高20倍病毒功能活力，大大提高慢病毒工业化生产的经济性。

16、作为本发明所述的慢病毒包装载体系统的优选实施方式，包括所述慢病毒载体、pmdlg载体、prsv-rev载体和pmd 2.g载体；所述慢病毒载体、所述pmdlg载体、所述prsv-rev载体和所述pmd 2.g载体的用量比为(3.5～4.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(1.5～2.5)；优选的，所述所述慢病毒载体、所述pmdlg载体、所述prsv-rev载体和所述pmd 2.g载体的用量比为4:1:1:2。

17、第四方面，本发明提供了一种试剂盒，包括所述的慢病毒包装载体系统。

18、第五方面，本发明将所述慢病毒载体、所述制备方法、所述的慢病毒包装载体系统、所述试剂盒在制备基因修饰细胞治疗产品中应用。如car-t、car-macrophage和tcr-t等等。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

20、本发明基于常见慢病毒表达载体进行质粒改造，将起始慢病毒载体的5‘ltr前的启动子换成强启动子cmv，将目的基因前的启动子换成了嗜淋巴细胞病毒来源的启动子htlv；或将5‘ltr前的启动子换成强启动子cmv，将目的基因前面的启动子换成了嗜淋巴细胞病毒来源的启动子sffv。所得改造慢病毒载体的感染滴度、功能滴度和物理滴度均显著提高，生物活性高。本发明的慢病毒包装载体系统最高可提高20倍病毒功能活力，大大提高慢病毒工业化生产的经济性，可用于基因修饰细胞治疗产品等领域的开发和应用。