一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法与流程

一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干pcr试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干pcr试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法。


背景技术：

2.镰刀菌病对于海水虾或淡水虾而言，是较为常见的疾病之一，尤其对越冬亲虾有较高的感染率。镰刀菌病病原包括腐皮镰刀菌(fusarium solani)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、三线镰刀菌(fusarium tricinctum)和禾谷镰刀菌(fusarium carum)等，主要寄生于虾的鳃、头胸甲、附肢体壁和眼球等部位，主要症状为感染部位变黑，例如寄生于鳃部时引起鳃组织坏死变黑，有人称之为“黑鳃病”，但是该症状与由细菌引起的“褐斑病”相似，很难从外观症状进行区分。
3.现有的镰刀菌病的检测方法，通常需要从病灶处取样然后借助显微镜等设备去进行检测，这种方法只能是在对虾发病后才进行检测，操作过程繁琐，而且灵敏度低无预警作用。因此，开发出一种可以在虾苗出现镰刀病症状之前即可快速检测到镰刀菌的方法，使养殖户有足够的时间做出相应的应对措施，从而避免虾苗出现镰刀菌病症状，具有十分重大的实际意义。
4.pcr技术是生物检测领域较为成熟的技术，且在pcr技术中，荧光定量pcr技术操作步骤较为简易，可以避免扩增产物引起的交叉感染，减少假阳性的发生，因此荧光定量pcr在生物检测领域的应用极为广泛。通常在荧光定量pcr技术中，需采用冻干pcr试剂，而冻干pcr试剂对储存条件苛刻，常需要在较低温度下保存和运输，成本较大。因此，制备一种可以常温下储存和运输的冻干pcr试剂，具有较大的经济意义。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中的缺点和不足，本发明提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干pcr试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
6.根据本发明的第一个方面，提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干pcr试剂，其特征在于：包括taq dna聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂；
7.上游引物的核苷酸序列为：5＇-gtcacgtcgagcttccatagc-3＇；
8.下游引物的核苷酸序列为：5＇-gaagttggggtttaacggcg-3＇；
9.荧光标记探针的核苷酸序列为：5＇-tagtagtaaaaccctcgttactgg-3＇。
10.优选地，荧光标记探针5＇端标记的荧光报告基团包括fam，3＇端标记的荧光猝灭基团包括mgb。
11.对于虾苗镰刀菌的基因序列进行全面分析后，选择以虾苗镰刀菌5.8srrna基因保守序列为靶标，在此基础上设计和优化得到的引物和荧光标记探针具有合适的长度和特定的碱基序列，对镰刀菌有较好的特异性，因而可以利用上述引物和荧光标记探针实现对镰
刀菌的特异性检测。
12.优选地，每管冻干pcr试剂包括1-20单位taq dna聚合酶、1-20pmol上游引物、1-20pmol下游引物、0.5-10pmol荧光标记探针、质量体积比为2-15％的冻干保护剂。其中，质量体积比为质量浓度，表示每单位体积中的质量是多少，单位为“kg/l”或“kg/m
3”，全文中的其他质量体积比表示的意义与此一致。
13.优选地，每管冻干pcr试剂包括7.5单位taq dna聚合酶、5pmol上游引物、5pmol下游引物、2.5pmol荧光标记探针、质量体积比为7.2％的冻干保护剂。
14.优选地，冻干保护剂包括海藻糖、蔗糖、葡萄糖、岩藻糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖苷、聚乙二醇中的至少一种。
15.根据本发明提供的第二个方面，提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干pcr试剂的制备方法，包括以下步骤：
16.(1)通过将taq dna聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂混合；
17.(2)将所得到的混合物进行冻干；
18.冻干的反应程序为-45℃，2h；-45℃，20pa，2h；-45℃，10pa，16h；25℃，10pa，2h。
19.通过选择合适的冻干程序和冻干保护剂，使得由taq dna聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂制备的冻干pcr试剂可以在常温下储存和运输，且该冻干pcr试剂还可以在高温下保持稳定一段时间，降低了储存和运输等成本。
20.根据本发明的第三个方面，提供一种检测虾苗镰刀菌的方法，采用上述用于检测镰刀菌的冻干pcr试剂进行检测。
21.优选地，上述检测虾苗镰刀菌的方法，包括如下步骤：s1.提取待测虾苗的dna；s2.利用复溶剂将冻干pcr试剂复溶后，以待测虾苗的dna为模板，进行pcr扩增；s3.分析pcr扩增产物。
22.优选地，复溶液包括以下组分：0.01-0.2μmol镁离子、0.25-2.5μmol三羟甲基氨基甲烷、0.25-5μmol钾离子、0-2％质量体积比的非离子型去污剂。三羟甲基氨基甲烷的英文别称为tris。
23.优选地，复溶液包括以下组分：0.05μmol镁离子、1.25μmol三羟甲基氨基甲烷、2.25μmol钾离子、0.1％质量体积比的非离子型去污剂。
24.影响pcr扩增的因素很多，特别是冻干pcr的各物料组成和复溶液的各物料组成都会对pcr扩增产生影响，本方案通过严格控制冻干pcr的物料组成和复溶液的物料组成，使冻干pcr试剂与复溶液相互配合，能够快速、有效地完成pcr扩增。
25.优选地，非离子型去污剂包括曲拉通x-100、吐温20、吐温80、np40中的至少一种。
26.优选地，pcr扩增的程序为：55℃，5分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒钟，60℃，25秒钟，40个循环；pcr扩增完成的时间不超过60分钟。
27.综上，本发明通过利用镰刀菌5.8s rrna基因设计特异的引物和荧光标记探针，并将引物和荧光标记探针与taq dna聚合酶、冻干保护剂一起冻干形成冻干pcr试剂，使得引物和荧光标记探针经过冻干后，比较稳定，不容易降解，可以常温运输和保存，适于野外使用，且减少运输和保存成本。另外，本发明利用该冻干pcr试剂应用于虾苗镰刀菌的检测中，该检测方法可以检测极低含量的镰刀菌，因此可以在虾苗出现镰刀菌病症状之前就可检测到镰刀菌，使养殖户可以根据检测结果做出相应的处理措施，避免虾苗出现镰刀菌病症状。
附图说明
28.图1为实施例1冻干pcr试剂的样品图；
29.图2为实施例2的pcr扩增曲线图；
30.图3为实施例3高温处理后的冻干pcr试剂的扩增曲线图。
具体实施方式
31.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
32.实施例1
33.制备冻干pcr试剂：
34.(1)引物的设计
35.对于虾苗镰刀菌的基因序列进行全面分析后，选择虾苗镰刀菌5.8s rrna基因保守序列为靶标，在此基础上设计和优化引物和荧光标记探针，得到的上游引物的核苷酸序列为：5＇-gtcacgtcgagcttccatagc-3＇，下游引物的核苷酸序列为：5＇-gaagttggggtttaacggcg-3＇，荧光标记探针的核苷酸序列为：5＇-tagtagtaaaaccctcgttactgg-3＇，荧光标记探针5＇端标记的荧光报告基团为fam，3＇端标记的荧光猝灭基团为mgb。
36.(2)冻干pcr试剂的配制以及冻干反应
37.按照以下配方配制没管待冻干的pcr试剂：7.5单位taq dna聚合酶，5pmol上游引物，5pmol下游引物，2.5pmol荧光标记探针，质量体积比为7.2％的海藻糖。将待冻干的pcr试剂加入pcr管中，随后将pcr管放入冻干机中制备冻干pcr试剂，其中，冻干的反应程序为：-45℃，2h；-45℃，20pa，2h；-45℃，10pa，16h；25℃，10pa，2h。待冻干的pcr试剂经过上述冻干反应后得到冻干pcr试剂，如图1所示。
38.实施例2
39.虾苗镰刀菌的检测：
40.本实施例利用实施例1中的冻干pcr试剂对虾苗中的镰刀菌进行检测，其检测方法的包括如下步骤：
41.s1.取30mg虾苗组织到无菌离心管中，用水生动物病毒dna/rna提取试剂盒(离心柱法)提取虾苗的dna；其中，水生动物病毒dna/rna提取试剂盒由广州华峰生物科技有限公司生产。
42.s2.按如下配比配制复溶液：0.05μmol镁离子，1.25μmol tris，2.25μmol钾离子，质量百分比为0.1％的吐温20，向冻干pcr试剂中加入22.5μl复溶液，使冻干试剂重新恢复至溶液状态，然后向其中加入2.5μl虾苗的dna溶液，使加入虾苗的dna溶液后的总体积为25μl；将上述最终得到的混合溶液进行快速pcr扩增；其中，pcr扩增的程序为：55℃，5分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒钟，60℃，25秒钟，40个循环；pcr扩增完成的时间不超过60分钟；
43.s3.分析pcr扩增产物。
44.本实施例共设置1个空白对照组、1个阴性对照组，三个实验组，其中，空白对照组在s2中加入的为2.5μl无菌水；阴性对照组在s2中加入的为2.5μl健康虾苗的dna溶液；三个
实验组在s2中加入的为2.5μl感染镰刀菌虾苗的dna溶液，分别记为镰刀菌阳性样品1、镰刀菌阳性样品2、镰刀菌阳性样品3。参考图2的实验结果，可以看出，空白对照组和阴性对照组的pcr测试结果为水平的扩增曲线，而镰刀菌阳性样品1、镰刀菌阳性样品2、镰刀菌阳性样品3的pcr测试结果为典型的“s”增长型扩增曲线，说明利用实施例1中的冻干pcr试剂按照上述pcr扩增程序可以对镰刀菌基因序列实现有效的扩增，且扩增40个循环扩增曲线就已经平台期，说明此时扩增过程已经基本完成，且整个扩增过程的时间在60分钟内就可以完成。
45.实施例3
46.冻干pcr试剂的长期稳定性测试：
47.向45℃储存一、二、四周和25℃储存三、六、十二个月的冻干pcr试剂与新鲜制备的冻干pcr试剂中分别加入22.5μl按照实施例2中s2配制的复溶液、以及2.5μl镰刀菌dna溶液，进行pcr扩增，其测试结果如图3所示。本实施例采用的冻干pcr试剂为实施例1中的冻干pcr试剂，所采用的pcr扩增程序与实施例2中s2的pcr扩增程序一致。
48.由图3可知，使用45℃储存一、二周和25℃储存三、六、十二个月的冻干pcr试剂与新鲜制备的冻干pcr试剂得到的扩增曲线呈现出良好的重合度，而使用45℃储存四周的冻干pcr试剂得到的扩增曲线虽然与其他扩增曲线有一定的偏差，但也呈现出典型的“s”增长型扩增曲线，说明本方案中提供的冻干pcr试剂可以能耐受25℃长期储存，45℃短期储存，具有较佳的常温储存稳定性。
49.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。