靶向人LILRB2的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及一种抗lilrb2的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途。

背景技术：

1、纳米抗体是目前最小的抗体分子，最初由比利时科学家hamers在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点：一是体积是普通抗体的1/10，因为体积小，其在动物组织体内的穿透力强，如，可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，而普通抗体却不能，这使得可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病；二是抗原特异性好；三是易于基因改造，方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；四是稳定性高，如，纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长(意味着药效时间更持久)，纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。

2、lilrb2，又称ilt4，主要在髓系细胞上表达，包括单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。基因学研究显示多种肿瘤微环境中的肿瘤关联巨噬细胞(tam)高表达lilrb2，抑制lilrb2(小鼠的对应蛋白叫pirb)降低treg和mdsc在肿瘤组织的侵入。动物实验显示pirb抗体抑制抑制肿瘤生长，并与pd-1抗体有协同作用。lilrb2主要在骨髓细胞表达、其它组织表达有限，这令on-target、off-tissue毒性比较轻微。人lilrb2是髓细胞成熟过程中重要的稳态表面调节因子，是一种有前途的、专门针对髓细胞功能测定的髓免疫检查点靶点，具有重要的治疗价值。

技术实现思路

1、现有技术中的scfv、fab或全igg类抗lilrb2抗体分子，结构复杂、分子较大，虽然能将活性分子连接到lilrb2上，但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低；纳米抗体分子较小、易于操作，但人源化程度低、亲和力不高，延长半衰期的性能有待进一步提高。

2、针对上述现有技术的不足，本发明提供一系列抗人lilrb2纳米抗体序列及制备方案。

3、第一方面，本发明提供一种抗lilrb2的纳米抗体，根据本发明的实施例，所述纳米抗体能够特异性结合lilrb2，且所述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr为选自下组的一种或多种：

4、(1)seq id no：14所示的cdr1，seq id no：15所示的cdr2，和seq id no：16所示的cdr3；

5、(2)seq id no：17所示的cdr1，seq id no：18所示的cdr2，和seq id no：19所示的cdr3；

6、(3)seq id no：20所示的cdr1，seq id no：21所示的cdr2，和seq id no：22所示的cdr3；

7、(4)seq id no：23所示的cdr1，seq id no：21所示的cdr2，和seq id no：24所示的cdr3；

8、(5)seq id no：25所示的cdr1，seq id no：26所示的cdr2，和seq id no：27所示的cdr3。

9、(6)seq id no：28所示的cdr1，seq id no：29所示的cdr2，和seq id no：30所示的cdr3。

10、(7)seq id no：31所示的cdr1，seq id no：32所示的cdr2，和seq id no：33所示的cdr3。

11、(8)seq id no：34所示的cdr1，seq id no：35所示的cdr2，和seq id no：36所示的cdr3。

12、(9)seq id no：25所示的cdr1，seq id no：37所示的cdr2，和seq id no：27所示的cdr3。

13、进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体是人源化的vhh或骆驼源化的vhh。

14、进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体具有如seq id no：3至seq idno：12任一项所示的氨基酸序列，或与seq id no：3至seq id no：12任一项所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

15、本发明所述的“至少80％同一性”为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性等≥80％的任何百分比的同一性。

16、第二方面，本发明提供一种融合蛋白，根据本发明的实施例，其包括能够特异性结合lilrb2的功能结构域，所述功能结构域由上述任一项所述的抗lilrb2的纳米抗体构成。

17、本发明提供的纳米抗体可以与其他的任意蛋白或物质融合，以实现不同的目的，例如与荧光蛋白、酶或放射性元等结合以实现易于检测的目的，再如与治疗lilrb2介导相关疾病的药物分子融合以实现更佳的治疗目的。与该纳米抗体融合的蛋白类型，本领域技术人员可以根据实际需要或目的合理选择，无论融合何种类型的物质融合，其也在本发明的范围内。

18、第三方面，本发明提供一种抗lilrb2的抗体，根据本发明的实施例，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由前述任一项所述的抗lilrb2的纳米抗体构成；

19、进一步，上述功能性片段为所述传统抗体的fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv或sdfv结构。

20、传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链具有轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)；重链具有重链可变区(vh)和重链恒定区(ch1，ch2，ch3和/或ch4)。在本发明公开了具有能够特异性结合lilrb2的纳米抗体的结构前提下，本领域技术人员容易想到利用本发明的纳米抗体对传统抗体以改造，例如将本发明纳米抗体的cdr区结构应用到传统抗体上，以获得可以特异性结合lilrb2的传统抗体，这类传统体也是属于本发明的保护范围；进一步地，基于传统抗体的结构，其部分结构例如fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv或sdfv结构等也是具有lilrb2结合特异性的，这也是属于本发明的保护范围。

21、第四方面，本发明提供了一种治疗疾病的组合物，其包括如上任一项所述的抗lilrb2的纳米抗体、如上所述的融合蛋白或如上所述的抗体，以及药学上可接受的辅料。

22、本发明所提供的药物组合物含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)，本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。

23、药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。

24、本发明所提供的药物的剂型并没有严格的限制，可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型，通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要治疗的患者。

25、第五方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的纳米抗体。

26、基于本发明公开的内容，本领域技术人员通过本领域常规技术容易获得编码上述纳米抗体以及融合蛋白的多核苷酸分子，并基于密码子的简并性，该多核酸分子是多变的，其具体的碱基序列存在多种可能性，基于此，无论其多核酸分子如何变化，只要其能够编码本发明的纳米抗体或融合蛋白即属于本发明的保护范围。

27、第六方面，本发明提供含有如上所述的核酸分子的载体。

28、第七方面，本发明提供含有如上所述的载体的重组细胞。

29、本发明实施例提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。

30、如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。

31、可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如deae-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸dna或rna、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的dna或rna表达载体。

32、本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于cho和cos细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。

33、第八方面，本发明提供制备如上任一项所述的纳米抗体的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。

34、需要说明的是，制备本发明的纳米抗体、融合蛋白和抗体可以通过化学合成的方法，也可以是通过基因工程技术实现，或者是其他的方法，无论以何种方法制备本发明前述的纳米抗体、融合蛋白或抗体，其都是属于本发明的保护范围。

35、第九方面，提供了本发明如上任一项所述的抗lilrb2纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞的用途，用于预防、治疗和/或改善实体瘤或血液瘤。

36、优选地，所述实体瘤为肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胰腺癌、胰腺导管癌、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性髓性白血病(aml)、子宫内膜癌、肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤、胃癌、肾癌、睾丸癌、食管癌、宫颈癌、鳞茎肺癌、白血病、甲状腺癌、肝癌、尿路上癌症或头颈部癌症。

37、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

38、一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。

39、本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

40、“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。

41、“纳米抗体”通常如在wo 2008/020079或wo 2009/138519中所定义，且在一个具体的方面通常表示vhh、人源化的vhh或骆驼源化的vh(诸如骆驼源化的人vh)，或通常表示序列优化的vhh(例如为了化学稳定性和/或溶解度、与已知人框架区的最大重叠和最大表达而优化)。“纳米抗体”用基因工程方法获得，主要有3类，第一类是从骆驼科动物hcab获得的重链可变区，为单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼ignar获得的重链可变区，用vnar表示。第三类是从人源或鼠源单抗获得的重链或轻链可变区，保留了抗原结合活性，但亲和性和可溶性大为下降。

42、“fc区”或“fc”是指免疫球蛋白重链的c端区，其含有铰链区的至少一部分、ch2结构域和ch3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如c1q)结合，包括天然序列fc区和变异fc区。通常，人igg重链fc区为自其cys226或pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。fc区的c-末端赖氨酸(残基447，依照eu编号系统)可以存在或可以不存在。fc还可以指隔离的这一区域，或在包含fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含fc区的结合蛋白”，还称为“fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列fc区包括人igg1，igg2(igg2a，igg2b)，igg3和igg4。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区包含抗体的两条重链的每一条的ch2和ch3恒定结构域；igm和igefc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。

43、“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(kd)表示，其中kd值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kd或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，可用任何有效的方法测量kd、ka和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如biacore)或kinexa来测量解离常数。

44、“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。

45、“核酸分子”旨在包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cdna。

46、本发明取得了以下有益的技术效果：

47、本发明的抗lilrb2纳米抗体能高亲和力结合人lilrb2，并阻断lilrb2和其受体hla-g的结合，从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。