一种基于RPA的猴痘病毒MPXV快速检测试剂、试剂盒以及检测方法

本发明涉及生物医学检测，尤其涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术(rpa)的猴痘病毒mpxv快速检测试剂盒。

背景技术：

1、猴痘(monkeypox)是一种由猴痘病毒(monkeypox virus,mpxv)引起的人畜共患病。1958年mpxv首次被报道，在1970年首例感染mpxv的病例发生在非洲刚果(金)，从一名疑似天花患者的标本中分离得到mpxv。此后在15个不同国家发现数千例人感染mpxv病例，其中11例在非洲国家，2003年在非洲以外的国家美国首次发现猴痘病例。2022年5月，多国相继发现猴痘确诊病例，who将猴痘的全球公共卫生风险评估为“高度风险”，截至2022年8月中旬，全球已感染3万多人，而且传播速率逐渐加快，预计今后将出现更多猴痘病例，更为需要注意的是，在2022年8月17日已有报道猴痘病毒可以通过人传染给狗。

2、mpxv与天花病毒(variola virus,varv)同属于痘病毒科(poxviridae)正痘病毒属(orthopoxvirus)。1980年人类消灭天花以来，mpxv成为对公共卫生影响最大的正痘病毒(orthopoxvirus,opxv)。mpxv基因组长度约为200kb，具有高度保守的编码复制和组装的中心区域，并且有很多可变的末端，包含参与宿主范围确定和致病的基因。该病毒有2个不同的分支：毒力更强的刚果盆地分支和较温和的西非分支，其中刚果盆地分支更容易导致人际传播。猴痘诊断检测作为疫情防控过程中的关键环节，需要多种诊断检测技术支持，提早做好多种诊断技术储备，进一步提高诊断技术的灵敏度、真阳性率、检测速度等技术参数，为特殊场所现场检疫、临床确诊、实验室鉴定等工作提供帮助。

3、为了准确识别猴痘病毒类型，通常使用包括rt-pcr(reverse transcription-polymerase chain reaction)的分子实时诊断方法。但是荧光定量pcr是现阶段病毒检测的优选方案，但其存在以下局限性：(1)容易产生气溶胶污染导致结果出现假阳性，需配备经专业培训并执pcr上岗证的技术人员、专业pcr认证实验室与价格昂贵的温度变换控制分析仪器；(2)传统荧光定量pcr样本核酸提取和扩增检测分两步骤进行，从取样到出具检测结果至少需要2-3小时以上。虽然最近已开发出通过单个靶基因的多重pcr实时扩增技术，但其多达90～120分钟的扩增检测过程与对实验设备和实验人员的严苛要求显然不适合于快速检测。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于rpa的猴痘病毒mpxv快速检测试剂、试剂盒以及检测方法。本发明具有准确率高、检测速度快的特点，能够特异性的对猴痘病毒mpxv检测。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案或组合：

3、首先一种基于rpa的猴痘病毒快速检测试剂，所述试剂包括用于检测猴痘病毒mpxv的双基因引物探针组，

4、所述双基因引物探针组包括f3l引物探针组和b6r引物探针组，

5、在f3l引物探针组中，

6、上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，

7、seq id no.1：tctcgtttagattttccatctgccttatcg；

8、下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，

9、seq id no.2：gagtactgccaaataactaggagagattggt；

10、f3l探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，

11、seq id no.3：cgtcaatgtctacacaggcataaaatgtaggagagt[dt-fam]a[thf][bhq-1]tttgtggtgcgctg(c3 spacer)；

12、在b6r引物组中，

13、上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，

14、seq id no.4：ccattatacgaagtgaattccaccatgacac；

15、下游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，

16、seq id no.5：caactaagatgtataacgccaccgatagaa；

17、b6r探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，

18、seq id no.6：cggaatgtcaacctcttcaattagaacacgga[dt-fam][thf]g[bhq-1]gtcaaccagttaaag(c3 spacer)。

19、进一步地，在f3l探针和b6r探针中，fam为荧光基团，bhq1为淬灭基团，thf四氢呋喃修饰位点，spacer c3为3’端空间子修饰。

20、在本发明中，提供上述试剂在检测检测mpxv病毒方面的用途。

21、在此基础上，本发明提供一种基于rpa的猴痘病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有用于检测mpxv的引物探针组的rpa扩增反应体系，

22、所述rpa扩增反应体系以50μl计包括：

23、模板rna 1.0～10μl；

24、上游引物1.0～5.0μl；

25、下游引物1.0～5.0μl；

26、探针引物0.5～5μl；

27、再水化缓冲液(rehydration buffer)29.5μl；

28、醋酸镁0.5～2.5μl；

29、rnase-free水灭菌去离子水补至50μl；

30、其中，所述上游引物、下游引物和探针引物为权利要求1-3中任一项所述的引物，引物的初始浓度均为1～40mmol/l，所述醋酸镁的初始浓度为50～280mmol/l。

31、本发明将引物探针组整合于单一扩增体系，实现实时快速扩增检测体系的微量化，对未知猴痘病毒的鉴定提供技术支持，做到早定型、早发现、早治疗。

32、本发明还提供一种基于rpa的猴痘病毒快速检测方法，所述快速检测方法采用上述的试剂盒，并包括以下步骤：

33、(1)rna模板提取：提取待测样品中的rna；

34、(2)rpa扩增反应：以步骤(1)提取的rna为模板，并采用试剂盒中的rpa引物与探针，在rpa反应管中进行rpa扩增反应；

35、(3)荧光检测分析rpa扩增产物。

36、进一步地，所述pra扩增反应的温度为25℃～42℃，扩增时间为1～60min，优选39℃扩增3～15min。

37、进一步地，所述的荧光检测分析所采用的设备包括能够识别并采集荧光信号的仪器，且其发光基因包括但不限于fam通道，还包括cy3，cy5，texas red，alexa flour，rox和joe所有系列的荧光检测基团。

38、进一步地，所述恒温反应选用任意能控温的装置，包括但不限于水浴锅、恒温箱等。

39、进一步地，所述待测样品包括疑似病例的皮肤病变(包含但不限于囊泡和脓疱夜或干燥的结痂)的至少一种。

40、本发明提供的基于重组酶聚合酶扩增技术(rpa)的猴痘病毒mpxv快速检测试剂盒可以广泛应用于临床上猴痘病毒mpxv的检测。多重实时rt-rpa(reverse transcription-recombinase polymerase amplification)检测技术基于rpa快速检测，于单一体系中对多个待测样本进行定量检测，具有准确率高、检测速度快的优势。

41、与现有技术相比，本发明的有益效果具体还表现在以下方面：

42、(1)本发明以mpxv的f3l和b6r为检测靶标，设计了rpa检测引物及探针，进而建立了一种基于恒温扩增的联合检测方法。

43、(2)本发明的检测多种感染呼吸道病毒的rpa引物及探针，能够用以完成对临床患者或门诊筛查多种院内感染呼吸道病毒的检测。本发明试剂盒具有特异性、价廉、灵敏、便携使用等特点。采用本发明的试剂盒能够有效、特异性地检测出单反应单拷贝及以上的多种院内感染呼吸道病毒。

44、(3)使用本发明的rpa引物及探针进行检测，可以在一个反应里实现检测一至多种不同的荧光信号，还可以对多个样本进行同时检测，有效的简化了系统设计，避免了由于样品光学检验时间不同造成的不准确性等问题。

45、(4)相对于“金标准”实时荧光定量pcr，采用本发明的试剂盒进行检测准确率较高、灵敏度较高，20分钟内即可完成检测。

46、(5)本发明采用mpxv的f3l和b6r为检测靶标进行rpa检测引物及探针设计，进行检测，准确性较高。

47、(6)本发明采用多酶优化配比并冷冻干燥形成干粉酶与扩增管中，减去了反转录过程，检测时间和操作步骤优化，方法更简便。

48、(7)本发明rpa引物及探针，已经过临床真实患者咽拭子样本检测验证，符合率100％，准确性及特异性非常高，更具有临床应用试验效果的说服力。