一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用。

背景技术：

1、木薯绵粉蚧(phenacoccus manihoti)，属半翅目(hemiptera)、粉蚧科(pseudococcidae)、绵粉蚧属(phenacoccus)；木薯绵粉蚧的活体呈粉红色，身体表面被有一层白色蜡粉，体缘有明显短蜡突。体式显微镜下，该虫的雌成虫呈椭圆形。9节触角，18对刺孔群，每对刺孔群都有2个大锥刺。足发达，有爪齿，后足的基节无透明孔。三格腺散布，盘形腹脐。木薯绵粉蚧背刺小，刺基部无三格腺，该种与木薯绵粉蚧和扶桑绵粉蚧的主要区别在于后两种缺少五格腺。

2、木薯绵粉蚧的一龄若虫活动频繁，可从寄主植株上爬行至附近未被侵染的植株，也能随动物、风等扩散。木薯绵粉蚧体型较小，尤其在卵或一龄若虫阶段，肉眼难以直接观察。寡食性。目前木薯绵粉蚧可以确定的寄主植物有木薯、木薯橡胶、大豆和柑橘等，其中木薯绵粉蚧最常寄生的植物品种是木薯。木薯绵粉蚧会破坏木薯植株顶端的分生组织，严重时木薯的叶片全部脱落，嫩枝枯死及枝条畸形，造成木薯根的损失，最终导致整株死亡，影响木薯的产量。随着栽培技术及木薯品种选育技术的不断进步，木薯的种植面积不断扩大，绵粉蚧危害问题逐渐成为影响木薯产量的重要因素之一。

3、木薯绵粉蚧原产于南美洲中部，是当地木薯上的一种重要害虫，后随寄主植物及其产品传播扩散，陆续在西非、中非、东非发现，给非洲木薯产业造成巨大损失。2008年(或许更早)传入泰国，目前已在亚洲的泰国、老挝、柬埔寨、越南、印度尼西亚，非洲的安哥拉、贝宁、布隆迪、刚果、科特迪瓦、冈比亚、加纳、几内亚、几内亚比绍、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、尼日利亚、卢旺达、塞内加尔、塞拉利昂、苏丹、坦赞尼亚、扎伊尔、中非共和国，南美洲的阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、巴拉圭、圭亚那等31个国家和地区严重发生，是威胁世界木薯生产安全的重大入侵害虫。经多方考证，目前我国尚未发现木薯绵粉蚧，然而，木薯绵粉蚧在我国广东、广西、海南等省的绝大部分地区以及福建、江西、贵州、云南等省份部分地区高度适生，在重庆、四川等部分地区中度适生。目前国际上用于木薯绵粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定。因此，尽快研发木薯绵粉蚧快速检测技术，加强对木薯绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯及蔬菜花卉产业和水果、棉花产业健康发展的必要前提。

技术实现思路

1、为解决现有技术中的不足，本发明提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用。

2、本发明提供了一种用于木薯绵粉蚧(phenacoccus manihoti)分子生物学鉴定的靶标，所述靶标为单一序列的靶标或两条序列组成的靶标组合，单一序列的靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示，靶标组合的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.5所示。

3、本发明还提供了所述靶标在鉴定木薯绵粉蚧中的应用。

4、本发明还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的引物组合，

5、所述引物组合包括一条正向引物和一条反向引物，正向引物的核苷酸序列如seqid no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、或者，所述引物组合包括两条正向引物和两条反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.6所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.7所示。

7、本发明还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的探针，

8、当使用上述中的引物组合，且引物组合包括一条正向引物和一条反向引物时，使用一条探针，探针的核苷酸序列如seq id no.4所示；

9、当使用上述中的引物组合，且引物组合包括两条正向引物和两条反向引物时，使用两条探针，探针的核苷酸序列如seq id no.4和seq id no.8所示。

10、使用两条探针时，核苷酸序列如seq id no.4所示的探针，5’端标记的荧光基团是fam，3’端标记的淬灭基团是bhq1；核苷酸序列如seq id no.8所示的探针，5’端标记的荧光基团是vic，3’端标记的淬灭基团是bhq1。

11、本发明还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的试剂盒，包括所述的引物组合，以及所述的探针。

12、本发明还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法，所述用于鉴定木薯绵粉蚧的方法为方法(a)或方法(b)：

13、所述方法(a)包括以下步骤：

14、(a)提取待测样品的dna作为扩增模板；

15、(b)使用荧光定量pcr方法进行检测，检测使用的引物组合包括一条正向引物和一条反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq idno.3所示；检测使用一条探针，探针的核苷酸序列如seq id no.4所示；

16、(c)若能够扩增得到明显荧光信号，说明待测样品含有木薯绵粉蚧；

17、所述方法(b)包括以下步骤：

18、(1)提取待测样品的dna作为扩增模板；

19、(2)使用荧光定量pcr或数字pcr方法进行检测，检测使用的引物组合包括两条正向引物和两条反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.6所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.7所示；检测使用两条探针，探针的核苷酸序列如seq id no.4和seq id no.8所示；

20、(3)若两个荧光通道均能够扩增得到明显信号，说明待测样品含有木薯绵粉蚧。

21、所述荧光定量pcr反应体系为：ii probe qpcr supermix 10μl，引物组合中的引物各5pmol，探针各5pmol，模板1μl，用无菌无核酸酶水补足至20μl；扩增反应条件为95℃预变性30s；95℃变性10s，61.4℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

22、所述数字pcr反应体系为：ddpcr supermix for probes 10μl，引物组合中的引物各18pmol，探针各5pmol，模板1μl，无菌无核酸酶水补至20μl；扩增反应条件为95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火&延伸60s，共45个循环；反应结束后保持4℃。

23、本发明基于木薯绵粉蚧高通量测序结果，筛选其基因组上多拷贝的特异性靶标序列，建立多通道荧光定量pcr检测方法，实现木薯绵粉蚧的快速鉴定。本发明的检测方法实用性强、准确性高、特异性强、操作简单迅速，可满足相关部门针对检验检疫或害虫监测/检测的需要。

24、本发明的有益效果为：

25、(1)本发明提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的靶标或靶标组合，所述靶标或靶标组合来源于木薯绵粉蚧；

26、(2)本发明提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法，通过多通道荧光定量pcr进行鉴定，可提高检测结果的准确性，缩短检测时间。