一种乙型流感病毒重组蛋白疫苗及其制备方法

本发明属于生物，具体涉及一种乙型流感病毒重组蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、流感病毒(influenzavirus)是一种囊膜病毒，属于正粘病毒科(orthomy-xoviridae)，根据核蛋白(np)和基质蛋白(m)的抗原性和基因型的不同，将其分为a、b、c、d四型。h1n1和h3n2亚型的甲型流感病毒(influenza avirus，iav)和乙型流感病毒(influenzabvirus，ibv)每年都会引起人类呼吸道疾病的暴发。迄今为止，乙型流感受到的关注较少，然而，乙型流感病毒感染对人群的发病率和死亡率有很大影响。在欧洲乙型流感约每7个流行季就会成为优势株。全球不同地区和不同年龄组人群均有乙型流感暴发，尽管乙型流感病毒在所有年龄组都会引起疾病，但乙型流感病毒感染的负担在儿童和年轻人中最高。有研究表明，甲型和乙型流感感染导致住院成人的发病率和死亡率相似，并且在门诊患者中也导致相似的临床特征。这些结果表明，乙型流感病毒可引起与甲型流感病毒一样严重的感染。此外，乙型流感流行导致的超额死亡负担较重，2005-2015年中国每年乙型流感平均超额死亡率为2.3/10万(95％ci：2.1～2.5)。一些严重并发症(如病毒性心肌炎、脑病等)也与乙型流感病毒感染密切相关。

2、乙型流感病毒基因组由8股单负链rna节段组成。其中rna节段4编码血凝素ha，ha能够与细胞表面的唾液酸受体结合，介导病毒与细胞的接触，是病毒感染细胞的第一步。ha具有较好的免疫原性，ha诱导的中和抗体能够在感染的第一时间作用于病毒，与病毒结合，抑制病毒入侵细胞，因此ha一直是研发流感疫苗的关键抗原。fischer等人通过利用计算机优化的方法，从自然hiv序列中“组装”出一种mosaic蛋白，使该蛋白含有最全覆盖范围的t细胞表位，通过比较发现，与hiv天然蛋白相比，无论是易变异的蛋白，还是保守蛋白，mosaic蛋白针对多样性hiv病毒群的覆盖范围都显著增加。按此方法设计的mosaic序列，不仅仅适用于hiv，也适用于其他变异较快的病原体，如流感病毒。

3、亚单位疫苗是指从病毒粒子中提取具有免疫原性的物质加入佐剂制备而成的疫苗。血凝素蛋白是流感病毒的主要表面抗原和保护性抗原，也是研究流感病毒亚单位疫苗的主要靶标抗原。随着基因工程技术的发展，人们将ha基因克隆到表达载体上，然后导入表达系统，在表达系统中大量的进行扩增和表达，可以获得大量的ha蛋白。通过这种方式生产ha蛋白，不仅产量高而且成本低，且具有很好的安全性，不存在毒力返强，病毒扩散，环境污染等问题。流感疫苗是预防流感最有效的手段，然而全球多个国家的研究显示，近年流行乙型毒株和疫苗所含乙型系别或疫苗株抗原性不匹配。同时，生产与当年流感病毒亚型相匹配的多价流感疫苗需耗时几个月，还需投入较大的财力及劳动力。因此，迫切需要研制一种能够预防季节性乙型流感的通用型疫苗。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种乙型流感病毒重组蛋白疫苗及其制备方法，本发明高效表达了乙型流感病毒重组ha蛋白核心抗原，且重组的ha蛋白有较高血凝价。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：基于马赛克策略的乙型流感病毒重组ha抗原的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)对乙型流感病毒进行分析，筛选得到乙型流感病毒ha氨基酸序列；

4、(2)采用马赛克策略对上述乙型流感病毒ha氨基酸序列进行分析，去除稀有表位并采用遗传算法进行优化后，获得由短肽组装而成的乙型流感病毒重组ha抗原。

5、研究表明，现有疫苗交叉保护性较差、生产周期较长且成本高。本技术发明人针对这一问题，以遗传算法合成马赛克疫苗策略为基础，通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功高效表达了乙型流感病毒重组ha蛋白核心抗原，且重组的ha蛋白有较高血凝价，证明该重组ha蛋白可进一步进行免疫原性的研究，为后续研发乙型流感重组蛋白疫苗提供了理论依据及物质基础。

6、作为本发明所述的基于马赛克策略的乙型流感病毒重组ha抗原的构建方法的优选实施方式，所述乙型流感病毒包括victoria亚系和yamagata亚系。

7、作为本发明所述的基于马赛克策略的乙型流感病毒重组ha抗原的构建方法的优选实施方式，所述稀有表位在ha氨基酸序列中出现的次数小于3。

8、作为本发明所述的基于马赛克策略的乙型流感病毒重组ha抗原的构建方法的优选实施方式，所述短肽由9个氨基酸组成。

9、本发明还提供一种乙型流感病毒重组ha抗原，所述乙型流感病毒重组ha抗原采用所述的构建方法制备得到。

10、作为本发明所述的乙型流感病毒重组ha抗原的优选实施方式，所述乙型流感病毒重组ha抗原包括victoria亚系重组ha抗原ham-vic和yamagata亚系重组ha抗原ham-yam。

11、作为本发明所述的乙型流感病毒重组ha抗原的优选实施方式，所述ham-vic的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述ham-yam的氨基酸序列如seq id no:2所示。

12、本发明还提供一种重组pfastbacdual-ham质粒，所述重组pfastbac dual-ham质粒通过保留乙型流感病毒重组ha抗原的胞外区域，去除乙型流感病毒重组ha抗原的信号肽，增加gp67信号肽，并依据昆虫细胞偏爱密码子进行优化得到的。

13、本发明还提供一种重组穿梭载体bacmid，包括所述的重组pfastbac dual-ham质粒。

14、本发明还提供一种表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

15、(1)通过基因合成技术获得表达乙型流感病毒ham重组蛋白的pfastbac dual-ham质粒；

16、(2)将步骤(1)获得的pfastbacdual-ham质粒转化至dh10bac感受态细胞，得到重组穿梭载体bacmid；

17、(3)将步骤(2)得到的重组穿梭载体bacmid转染昆虫细胞，得到杆状病毒；

18、(4)将步骤(3)的杆状病毒进一步纯化，得所述表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒。

19、作为本发明所述的表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中的纯化为将杆状病毒继续接种至生长状态良好的昆虫细胞中，培养至获得第四代杆状病毒。

20、本发明还提供一种表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒，采用所述的表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒的制备方法制备得到。

21、本发明还提供所述的表达乙型流感病毒ham重组蛋白的重组杆状病毒在制备乙型流感疫苗、预防或治疗乙型流感的药物中的应用。

22、本发明还提供一种乙型流感病毒重组蛋白疫苗，包括所述的重组杆状病毒。

23、作为本发明所述的乙型流感病毒重组蛋白疫苗的优选实施方式，所述乙型流感病毒重组蛋白疫苗还包括佐剂。

24、本发明的有益效果为：本发明通过mosaic疫苗设计方法，结合遗传算法优化蛋白序列，设计了包含b型victoria亚系和yamagata亚系的流感病毒覆盖有最多t细胞表位的mosaicha序列；本发明利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达纯化重组ha蛋白，成功高效表达了乙型流感病毒重组ha蛋白核心抗原，且重组的ha蛋白有较高血凝价，该重组ha蛋白可进一步进行免疫原性的研究，为后续研发乙型流感重组蛋白疫苗提供了理论依据及物质基础。