一种非洲猪瘟病毒鉴别检测方法

本发明涉及生物检测，具体涉及非洲猪瘟病毒的鉴别和检测。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、出血性和高度接触性传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(woah)将其列为法定报告动物疫病，中国也将其列为一类动物疫病。由于尚无有效的治疗药物和疫苗投入使用，疫情发生后，仅能依靠扑杀、消毒等基础措施进行防控，到目前为止扑杀生猪超过119.66万头，给中国生猪养殖业和国民经济带来巨大冲击。面对非洲猪瘟带来的威胁与挑战，除建立高水平的生物安全体系之外，开发出安全高效的非洲猪瘟疫苗对该病的防控具有重要作用。asfv是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒粒子呈二十面体对称，直径约为200nm，病毒基因组为170-193kb，具有151-167个开放阅读框(open reading frame,orf)。与其它的核质大dna病毒(nucleocytoplasmiclarge dna viruses,ncldv)一样，asfv编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如i型干扰素和细胞凋亡途径等。随着对asfv基因功能的不断探索，研究人员发现当敲除其某些毒力基因、多基因家族及免疫逃逸相关基因后，可显著降低病毒毒力或增加宿主的免疫应答，以此构建的基因缺失疫苗可以对强毒感染提供良好的免疫保护。其中美国构建的ii型非洲猪瘟i177l基因缺失株在越南上市。对我国非洲猪瘟的监测造成巨大的压力，因此急需开发针对该疫苗株将来临床应用时配套的鉴别诊断方法。

2、asfv常用的诊断方法包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断可靠性高，但费时费力，需要高级别生物安全实验室，不适于大规模检测；血清学检测方法操作简便，其中酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)[20-22]和间接免疫荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody assay，ifa)是最常用的检测方法；分子生物学诊断方法的准确性、灵敏度和特异性都较高，其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)因其高通量、易操作、耗时短等优点，成为是国际贸易中oie指定的asfv检测方法。

3、实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)方法将光谱技术引入到pcr反应中，通过荧光信号积累实时定量监测特异性扩增产物总量，较常规pcr方法具有更高的特异性和敏感性。研究人员以asfv的p72等保守基因为靶标设计引物和探针建立的taqmanqpcr能准确、高效的特异性鉴别asfv。此外，felicity j haines、史喜菊等人还进一步建立了同时鉴别asfv与csfv、pcv2、prrsv等多种病毒的感染的双重或多重qpcr检测方法，可以一步快速、准确地鉴别检测不同病原体。

4、目前，在cn 113718058 a公开了一种区分检测cd2v基因缺失株、mgf基因缺失株以及cd2v基因和mgf基因缺失株的pcr检测方法、试剂盒；在cn 112646934 b中公开了一种鉴别b646l、egfp和mcherry基因的多重荧光qpcr检测方法、试剂盒；大多是根据asfv p72基因设计的，无法区分ii型asfv野毒感染和i177l基因缺失株免疫。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了提供一种快速、准确区分ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别检测方法。

2、第一方面，本发明提供一组灵敏度和特异性较高的双重荧光定量pcr特异性引物。

3、所述双重荧光定量pcr特异性引物是用于鉴别检测ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株。

4、本发明引物设计根据genbank中登录的非洲猪瘟cn/hlj/18基因组序列(mk333180.1)和hlj/18-δi177l候选疫苗株的基因缺失策略，利用primer premier 5.0软件选择p72基因(genbank no.22220311)、i177l(genbank no.41902005)基因区域分别设计的2对引物。

5、进一步的，所述ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量pcr特异性引物组包括检测p72基因的上游引物a和下游引物a，检测i177l基因的上游引物b和下游引物b。

6、进一步的，所述p72基因的上游引物a和下游引物a核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2；所述i177l基因的上游引物b和下游引物b核苷酸序列如seq id no.3和seqid no.4。

7、第二方面，本发明还提供一组检测ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组。

8、进一步的，所述ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组分别是检测探针c和检测探针d；

9、所述探针c的核苷酸序列如seq id no.5；探针d的核苷酸序列如seq id no.6。

10、优选的，所述特异性荧光探针的荧光基团选自用fam和/或rox；所述特异性荧光探针的淬灭基团选自bhq1和/或bhq2。

11、在一种实施例中，选用fam和rox 2种5'修饰基团，其波长处于不同的光谱范围，相互干扰少，具有明显的区分效果和信号强度。

12、通过采用上述的引物组和检测探针组进行ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别时，对模板dna的扩增效率更高，有利于得到敏感性更高、最低检测限更低的检测结果，从而使得检测结果更加准确。

13、第三方面，本发明提供一种区分ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括p72基因的上游引物a和下游引物a，i177l基因的上游引物b和下游引物b，检测探针组c和d，进一步所述试剂盒中还包括dna提取试剂、荧光定量pcr扩增试剂、阳性对照和阴性对照。

14、第四方面，本发明提供一种上述试剂盒的应用，采用如下的技术方案：一种上述试剂盒的应用，所述试剂盒用于ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株感染的鉴别检测。

15、第五方面，本发明还提供一种ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：

16、s01、提取待检测核酸，得到核酸样品；

17、s02、准备pcr反应体系溶液，其中加入引物组为seq id no.1，seq id no.2和seqid no.3和seq id no.4；加入探针组为seq id no.5和seq id no.6。

18、s03、进行pcr反应；

19、s06、对实验结果进行判定分析。

20、s07、实验结果分析。

21、ct值为38定为判定检测结果阳性与阴性的临界值；当ct值≤38，判探针相对应的基因为阳性；ct值＞38，判为阴性；

22、当对敏感性要求更高时，可将阳性ct判定值提高至40；

23、当对稳定性要求更高时，可将阳性ct判定值降低至35。

24、本发明的有益效果：

25、1、本发明建立了一种特异性强、敏感性高、重复性好，可以快速、高效鉴别ii型非洲猪瘟病毒i177l基因缺失株与ii型非洲猪瘟病毒流行株的双重qpcr方法。提供了配套的能区分疫苗免疫与野毒感染动物的鉴别检测方法，对其临床应用提供了有效的技术支持。

26、2.、本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需一次qpcr扩增即可鉴别出两个基因，节约了检测成本和时间。