一种实现细胞分化的体外培养法以及由此得到的细胞群及其用途

本技术具体涉及一种角膜内皮细胞的获得方法，初始细胞可以为多能干 细胞来源，也可以为神经嵴细胞来源。具体地，本技术公开了使用化学成 分完全明确的培养基将多能干细胞定向高效地诱导生成角膜内皮细胞。 本技术还涉及一种cec细胞及其在治疗角膜内皮病中的应用。

背景技术：

1、目前，全球因角膜内皮损伤需要角膜移植的患者高达650万，而实际得 到移植的只占2％，角膜供需严重失衡。2018年kinoshita发表于“新英格兰” 的一项工作表明，体外培养的人原代角膜内皮细胞(cec)移植于患者体内 具有显著的治疗效果。多能干细胞(psc)分化获得的角膜内皮细胞，不需 依赖捐献的角膜，在治疗角膜内皮病方面具有重大的临床应用价值。科学家 们已经尝试使用人胚干细胞(hesc)或诱导多能干细胞(ipsc)分化获得 角膜内皮细胞，主要是模拟体内发育分为两个阶段：第一阶段，将hescs 或ipsc诱导分化为神经嵴细胞(ncc)；第二阶段，由神经嵴分化获得成 熟的角膜内皮细胞。从目前已发表工作看，第一阶段比较成熟，但第二阶段 (包括从多能干细胞向角膜内皮细胞分化，虽部分文章未提及神经嵴细胞， 但同样经历了此中间过程)的分化方法良莠不齐、大多依赖于共培养，培养 基成分不明确、含有动物源性，且涉及的分化通路不明晰。

技术实现思路

1、本技术提供了：

2、1.用于在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞时加入培养基的组合 物，其包括：tgf-β抑制剂、wnt激活剂以及tgf-β激活剂；可选地包 括rock抑制剂。

3、2.如项1所述的组合物，其中，

4、所述tgf-β抑制剂为alk4受体抑制剂，其选自sb431542、sb505124、 a83-01中的一种或两种或三种；

5、所述wnt激活剂选自gsk3β抑制剂、wnt3a、wnt1中的一种或两 种或三种；所述gsk3β抑制剂选自chir99021、gsk3β抑制剂ix、gsk3β 抑制剂vii、indirubin、l803-mts、tws119、azd2858、ar-a014418、 tdzd-8、ly2090314、2-d08、im-12、1-azakenpaullone、sb216763中的一种或两种或三种以上；

6、所述tgf-β激活剂选自tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、sri-011381(氢 氯化物)中一种或两种或三种以上；

7、优选所述rock抑制剂为y-27632。

8、3.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的组合物，其包括： tgf-β抑制剂、wnt抑制剂以及bfgf抑制剂；可选地包括rock抑制剂。

9、4.如项3所述的组合物，其中，

10、所述tgf-β抑制剂为alk4受体抑制剂，其选自sb431542、sb505124、 a83-01中的一种、两种或三种；

11、所述wnt抑制剂为dkk2多肽或wnt信号通路抑制剂，其选自 xav-939、iwr-1中的一种或两种；

12、所述bfgf抑制剂为选自：vegfr抑制剂、fgfr1抑制剂以及pdgfrβ 抑制剂中的一种、两种或三种；优选地，所述bfgf抑制剂为su-5402；

13、优选所述rock抑制剂为y-27632。

14、5.用于将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的培养基，其包括：如项1 或2所述的组合物；还包括：

15、a)基础培养基；以及

16、b)血清替代物、谷氨酰胺或l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的稳定化二肽、胰岛 素-转铁蛋白-硒添加剂(its)、非必需氨基酸、l-抗坏血酸和维生素c合剂 (l-aa)；

17、其中，所述tgf-β抑制剂的加入至培养基的浓度为1μm-100mm；所 述wnt激活剂的加入至培养基的浓度为：10nm–100μm；所述tgf-β激 活剂的加入至培养基的浓度为：0.1ng/ml–100μg/ml；所述rock抑制剂 的加入至培养基的浓度为10nm-100μm。

18、6.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的培养基，其包括：如项3或4所述的组合物；还包括：

19、a)基础培养基；以及

20、b)血清替代物、谷氨酰胺或l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的稳定化二肽、胰岛 素-转铁蛋白-硒添加剂(its)、非必需氨基酸、l-抗坏血酸和维生素c合剂 (l-aa)；

21、其中，所述tgf-β抑制剂在培养基中的浓度为1μm-100mm；当所述 wnt抑制剂是蛋白时，其在培养基中的浓度为1ng/ml-100μg/ml，当所述 wnt抑制剂是小分子化合物时，其在培养基中的浓度为10nm-10μm；所 述bfgf抑制剂的在培养基中的浓度为10nm-10μm；所述rock抑制剂 在培养基中的浓度为10nm-100μm。

22、7.如项5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物为选自下组的一 项或多项：kosr、msc无血清添加剂、ultrosertm g。

23、8.如项5或6所述的培养基，其中，所述非必需氨基酸为选自下组 的一项或多项：甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、 l-脯氨酸、l-丝氨酸。

24、9.如项5或6所述的培养基，其中，所述基础培养基为选自下组的 一项或多项：ko-dmem、ko-dmem/f12、dmem、α-mem、f-12、 mem、bme、rpmi 1640、g-mem。

25、10.如项5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物占所述基础培养 基的1％-50％；所述谷氨酰胺或l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的稳定化二肽占所述 基础培养基的1％-20％；所述its占所述基础培养基的1％-20％；所述非必 需氨基酸占所述基础培养基的1％-20％；所述维生素合剂(l-aa)占所述基 础培养基的0.1％-10％。

26、11.一种通过体外培养使多能干细胞分化为神经嵴细胞(ncc)的方法， 其包括：使用如项1或2所述的组合物或项5、以及引用项5时的项7-10的任一 项所述的培养基对多能干细胞进行培养。

27、12.一种通过体外培养使神经嵴细胞(ncc)分化为角膜内皮细胞(cec) 的方法，其包括：使用项3或4所述的组合物或项6、以及引用项6时的项7-10 的任一项所述的培养基对多能干细胞进行培养。

28、13.一种通过体外培养法使多能干细胞分化为角膜内皮细胞(cec) 的方法，其中，所述方法为两阶段培养法，首先在第一阶段多能干细胞 分化为神经嵴细胞(ncc)，然后在第二阶段神经嵴细胞(ncc)分化为 角膜内皮细胞(cec)，其中第一阶段使用项11的方法而第二阶段采用项12 的方法。

29、14.一种角膜内皮细胞(cec)，所述角膜内皮细胞表达下述标志物的 一种或多种：dcn、lum、sparcl1、serpinf1、serping1、cxcl3、aebp1、 rarres2、pcolce、htra1、ftl、angptl7、lox、pmp22、vmo1、 emp3、arnt、sdc2、colec12、anxa5、jun、sqstm1、ctsz、plpp3、ctsl、lmna、gadd45a、abca6、tsc22d1和timp3。

30、15.一种药物组合物，其包含如项14所述的cec细胞以及药学上可接受 的辅料。

31、16.如项14所述的cec细胞或如项15所述的组合物在制备用于治疗与角 膜内皮细胞相关的疾病的药物中的用途。

32、17.如项16所述的用途，其中所述与角膜内皮细胞相关的疾病包括： fuchs角膜内皮营养不良、虹膜角膜内皮综合症、后部多形性角膜营养不良、 先天性遗传性角膜内皮营养不良、以及需角膜内皮移植治疗的继发性疾病。

33、本技术取得的有益技术效果

34、本技术建立了一种成分明确、不含动物源性，无需共培养，仅由小分子 或因子诱导就可获得角膜内皮细胞的分化方法，并描述了该细胞的新型标志 物，为治疗角膜内皮病提供基础，更好地解决全球角膜短缺的困境。